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优化类人胶原蛋白Ⅱ基因工程菌的培养基组成及流加操作

2020-12-10阅读(389)

优化类人胶原蛋白Ⅱ基因工程菌的培养基组成及流加操作

论文摘要

本文主要研究了基因重组Escherichia coli BL21的分批培养和分批-补料培养时的培养基组成,并运用响应面分析方法及代谢流分析方法分析各种培养基组成对大肠杆菌表达类人胶原蛋白Ⅱ的影响,此外,对补料培养基的流加方式做了突破性的革新。优化结果如下：用摇瓶小试实验优化培养基组成：诱导前,控制碳氮比为4.47：1（mol:mol）,即葡萄糖和氮源浓度分别为0.085mol/L和0.019mol/L时,菌体生长情况最优,有害代谢副产物特别是乙酸的生成量接近最低。诱导后,碳氮比控制在3.82：1（mol:mol）,即葡萄糖和氮源浓度分别为0.065mol/L和0.017mol/L时,类人胶原蛋白比生成量达到最高,而且乙酸生成量接近最低。此外,当仅提高葡萄糖含量时,乳酸、丙酸的含量相应增加,三羧酸循环中间代谢物如柠檬酸、L-苹果酸、琥珀酸含量反而降低。用发酵罐培养实验优化培养基组成：基于代谢流分析（metabolic flux analysis, MFA）对分批阶段和补料阶段的培养基进行优化,代谢流分析结果显示：分批阶段的最优碳氮比为2.36：1（mol:mol）,诱导前补料阶段的最优流加补料碳氮比为5.12：1（mol:mol）,最优碳氮比控制策略下,细胞干重和蛋白产量分别达到67.2g/L和10.8g/L本实验采用了发酵控制器对流加方式采取溶氧实时反馈调控,与传统周期式补料流加方式相比,菌体量和类人胶原蛋白产量都有了明显的提高,且产量稳定,代谢副产物如乙酸的生成量明显低于后者。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  • 1.1 胶原蛋白概述
  • 1.2 类人胶原蛋白Ⅱ的优越性及应用
  • 1.3 高密度发酵及过程优化
  • 1.3.1 高密度发酵的影响因素
  • 1.3.2 高密度发酵的调控
  • 1.4 代谢流分析
  • 1.4.1 代谢流分析方法
  • 1.4.2 大肠杆菌初级代谢相关途径的代谢流分析
  • 1.5 响应面优化法
  • 1.5.1 Box-Behnken实验设计（BBD）
  • 1.5.2 中心复合设计（CCD）
  • 1.6 本研究的目的、意义及内容
  • 第二章 实验材料及方法
  • 2.1 菌种
  • 2.2 主要仪器设备和试剂
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 菌种活化
  • 2.3.2 种子培养
  • 2.3.3 摇瓶培养实验
  • 2.3.4 发酵罐分批-补料培养
  • 2.3.5 菌体收集
  • 2.3.6 目标蛋白的分离
  • 2.4 分析方法
  • 2.4.1 酸等有机酸检测
  • 2.4.2 菌体浓度测定
  • 2.4.3 细胞干重测定
  • 2.4.4 残糖测定
  • 2-R测定'>2.4.5 NH2-R测定
  • 2.4.6 总蛋白测定
  • 2.4.7 类人胶原蛋白Ⅱ含量测定
  • 2.4.8 呼吸商
  • 第三章 HPLC检测有机酸
  • 3.1 HPLC系统
  • 3.2 液相检测条件摸索
  • 3.2.1 波长选择
  • 3.2.2 流动相及浓度
  • 3.2.3 pH
  • 3.2.4 温度
  • 3.2.5 乙腈添加量
  • 3.2.6 流速
  • 3.3 液相检测
  • 3.3.1 流动相的配制
  • 3.3.2 样品预处理
  • 3.3.3 保留时间的确定
  • 3.3.4 有机酸标准曲线的绘制
  • 3.3.5 进样分析
  • 3.4 本章小结
  • 第四章 摇瓶发酵培养基的优化
  • 4.1 摇瓶发酵过程
  • 4.2 培养基组成的变化对菌体生长的影响
  • 4.3 培养基组成的变化对类人胶原蛋白Ⅱ表达量的影响
  • 4.4 培养基组成的变化对代谢副产物的影响
  • 4.4.1 甲酸
  • 4.4.2 L-苹果酸、琥珀酸、柠檬酸
  • 4.4.3 乳酸
  • 4.4.4 丙酸
  • 4.4.5 乙酸
  • 4.5 本章小结
  • 第五章 发酵罐培养基的优化及发酵调控
  • 5.1 发酵参数控制
  • 5.1.1 pH值
  • 5.1.2 温度
  • 5.1.3 溶氧
  • 5.2 不同培养基的发酵培养
  • 5.2.1 不同碳氮比对细胞生长、类人胶原蛋白表达的影响
  • 5.2.2 不同碳氮比组成对重组大肠杆菌代谢流分布的影响
  • 5.3 本章小结
  • 第六章 发酵罐补料培养基的流加优化
  • 6.1 发酵参数调控
  • 6.1.1 pH值
  • 6.1.2 温度
  • 6.1.3 溶氧
  • 6.2 流加操作优化
  • 6.2.1 流加操作方式的优化
  • 6.2.2 流加操作方式对发酵的影响
  • 6.3 不同补料培养基流加操作的发酵培养
  • 6.3.1 不同碳氮比流加操作对细胞生长,蛋白表达的影响
  • 6.3.2 不同补料碳氮比对重组大肠杆菌代谢流分布影响分析
  • 6.4 本章小结
  • 6.5 展望
  • 参考文献
  • 附录
  • 攻读硕士学位期间取得的学术成果
  • 致谢

    • 相关论文文献

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