论文摘要
干细胞是存在于胚胎发育阶段和成熟个体不同组织内具有自我更新和分化潜能的一类细胞。目前主要研究两大类干细胞,其一是胚胎干细胞,其二是成体干细胞。胚胎干细胞由于其培养成本较高,且涉及伦理问题因素,使得其在组织工程领域的研究受到一定程度的限制。而成体干细胞可以从成熟个体的多种组织中分离得到,且体外扩增较为方便,因而受到很多学者的青睐。骨髓是机体最主要的造血组织,同时其又蕴含有多种类型的干细胞,因而也是机体内最大的成体干细胞库。骨髓来源细胞（bone marrow derived cells, BMDCs）中主要包含两种类型的干细胞,即造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSC）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）。干细胞的迁移、增殖、分化过程受到组织微环境中多种细胞成份和体液成份的联合调控。充分认识干细胞的多向分化潜能和机制有助于更加深刻认识个体发育、组织再生以及肿瘤发生等诸多生命过程,为利用干细胞的分化潜能和分泌能力促进各种创伤的修复和疾病的临床治疗提供重要的理论和实验依据。然而目前国内外不同的研究小组对于BMDCs的分化潜能仍持有不同观点,考虑到很多已观察到的分化现象都是利用体外诱导手段,在体内能否真正实现相应的分化表型还有待证实,因此进一步系统地探讨骨髓来源细胞在体内的多向分化潜能和分化机制仍然是干细胞研究的一个重要方向。胃肠道是人体进行食物消化、营养吸收和免疫反应的重要器官,同时和这些功能相适应,胃肠道上皮组织又是人体内增殖能力最为旺盛、更新速度最快的组织之一。胃肠道上皮细胞的快速更新得益于肠道干细胞的不断复制和分裂。骨髓来源细胞进入肠道后会对肠道微环境产生什么影响?其是否能够分化为肠上皮细胞?是否会影响胃肠道运动功能?国外学者曾报道在接受骨髓移植的临床患者和实验动物胃肠道内,都能够发现骨髓来源细胞分化为受体的肠上皮细胞。这既是对骨髓来源细胞分化潜能的一个新认识,同时也是对肠上皮细胞起源认识的一个新补充。然而骨髓来源细胞在肠道内的很多生物学特点还没有明确,例如迁移路径、分化潜能、细胞起源、上皮分化机制等等。在本课题中,我们首先使用全身电离辐射对C57BL/6小鼠造成全身多组织多脏器损伤,随后利用GFP小鼠通过骨髓移植建立骨髓嵌合小鼠动物模型,在嵌合鼠体内分析BMDCs的多向分化潜能。最后选定肠道作为研究对象,探讨BMDCs对辐射损伤肠道Cajal细胞（Interstitial cells of Cajal, ICC）的修复作用,并重点研究BMDCs能否分化为肠上皮细胞及调控其分化过程的具体机制。我们的工作为深入研究BMDCs在肠道内的分化潜能、分化机制,以及肠上皮更新动力学提供了新的理论指导和实验依据。本研究主要包括四部分内容：一、GFP-C57BL/6骨髓嵌合小鼠的建立及评价复制骨髓嵌合小鼠模型前首先对使用的GFP转基因小鼠进行评价,然后使用不同照射剂量对C57BL/6小鼠进行全身照射,评估移植组和对照组之间外周血白细胞变化和照射后14天存活率,确定最佳照射剂量。测定长期嵌合情况下,嵌合鼠骨髓细胞的嵌合比例,即骨髓单个核细胞、造血干细胞、以及间充质干细胞中GFP阳性细胞所占比例。二、骨髓来源细胞在体内的多向分化潜能研究分析移植后不同时间供体BMDCs对骨髓和脾脏这两个造血器官的重建作用,并通过免疫荧光双标分析BMDCs向不同胚层组织细胞的分化潜能,包括：（1）中胚层：骨髓细胞、脾细胞、肾小球血管系膜细胞；（2）内胚层：肺泡上皮细胞、肝细胞；（3）外胚层：神经元、皮肤毛囊细胞和表皮细胞。三、骨髓来源细胞对肠道ICC放射损伤的修复作用研究分析电离辐射对肠道Cajal细胞（Interstitial cells of Cajal, ICC）的损伤效应,移植的GFP小鼠BMDCs能否在肠道肌层内分化为ICC及其他细胞。四、骨髓来源细胞转分化为肠上皮细胞的现象及机制研究首先探讨BMDCs能否在肠道内分化为肠上皮细胞；第二分析损伤肠道中趋化因子SDF-1的表达变化及辐照后肠上皮细胞对BMDCs的趋化作用和BMDCs在肠道内的迁移途径,第三探讨BMDCs在体内转分化为肠上皮细胞的可能机制、具体哪一类骨髓干细胞能够分化为肠上皮细胞、MSC是如何获取肠上皮细胞表型的。本课题取得以下主要实验结果和结论：1.10Gy照射后移植BMDCs能够建立长期稳定的GFP-C57BL/6骨髓嵌合小鼠对小鼠进行10Gy全身照射并经尾静脉输入1.5×107个GFP小鼠BMDCs,移植后14天时受体小鼠的存活率可以达到93%以上,且外周血白细胞水平基本恢复至正常水平。嵌合小鼠可以长期存活,但毛发逐渐白化。移植后14个月受体骨髓GFP阳性率可到90%以上。其中HSC和MSC的GFP阳性率分别为99.95%和96.84%。2.首次全身性系统性观察了BMDCs在体内的多向分化潜能10Gy全身照射可导致全身多组织多脏器辐射损伤,BMDCs可参与各种辐射敏感和相对不敏感组织的损伤修复过程。移植早期BMDCs向不同脏器定植能力的差异主要取决于各脏器的辐射敏感性及损伤程度。BMDCs最先出现于骨髓和脾脏并重建造血功能,随后其他脏器内供体细胞数量开始增多。BMDCs可在体内分化为骨髓和脾脏的各种血细胞、肾小球血管细胞和肾小管上皮细胞、肺泡上皮细胞、肝细胞和卵圆细胞、神经元、皮肤毛囊细胞和表皮细胞等细胞类型。其主要是通过移植后早期定植的BMDCs在微环境因素诱导下分化而来的。结果表明BMDCs除具有向中胚层起源细胞分化的能力以外,还具有跨胚层分化潜能。3.电离辐射对肠道Cajal细胞具有损伤效应Cajal细胞可以产生慢波电位,是胃肠道蠕动的起搏细胞。不同剂量的电离辐射可引起该细胞密度显著下降,使得其细胞突起明显减少,所形成的细胞网络变得稀疏,并可以引起其标志物和重要功能分子c-Kit表达水平显著下降。其细胞数量减少和受照剂量在一定范围内呈线性相关。10Gy照射后3dICC密度可减少53.4%、c-Kit表达水平减少74.5%。我们首次发现电离辐射可引起ICC损伤,这一发现可从细胞机制上解释为何电离辐射后的患者和实验动物容易出现肠梗阻和肠套叠等临床表现。4.首次发现BMDCs能够分化为肠壁肌层中Cajal细胞和巨噬细胞Cajal细胞（ICC）对各种损伤因素都非常敏感,因此探讨损伤后ICC的细胞补充来源非常重要。发育学研究表明ICC不是起源于神经外胚层,而是起源于间叶组织,在新生个体消化道内某些特殊表型的平滑肌细胞可能是ICC的祖细胞。通过研究我们首次发现移植后小鼠肠道内BMDCs能够分化为ICC,骨髓移植后0%-11.2%的ICC可呈GFP和c-Kit双阳性。这是对BMDCs分化潜能的新认识,同时也为ICC起源研究提供了新的线索。5. BMDCs可在受体小肠内自发的连续的分化为小肠上皮细胞。位于肠上皮层当中的BMDCs可以表达肠上皮细胞标志物广谱细胞胶蛋白（PCK）,而不表达血系细胞标志物CD45,表明其能够分化为肠上皮细胞。上皮层内少量BMDCs可以表达神经细胞标志物Chromogranin A,表明其可分化为肠神经内分泌上皮细胞并影响肠道内分泌功能。免疫电镜证实上皮内供体来源细胞具有正常肠上皮细胞的超微结构特点。图像分析和流式细胞计数表明供体来源肠上皮细胞约占全部上皮细胞的9.41%-16.07%。6.电离辐射损伤后的肠道可以趋化BMDCs向肠道内迁移定植SDF-1/CXCR4是目前发现的最重要的趋化效应作用轴。受照后6h起,肠道中SDF-1的mRNA水平就显著增加,至24h增加约6倍；SDF-1的蛋白表达增加可维持到受照后8d,提示辐照损伤后肠道除了依靠自身干细胞进行损伤修复以外,还可在一定时期内通过趋化BMDCs促进损伤修复。骨髓间充质干细胞表达SDF-1的受体CXCR4,可对损伤后肠上皮增加的SDF-1做出趋化反应。10Gy照射后的肠上皮细胞株IEC-6对BMDCs具有显著的趋化作用,SDF-1的拮抗剂AMD3100可以部分阻断该效应。趋化3h后受照IEC-6对于MSC的趋化作用较对照组增加43.8%,而对HSC的趋化作用仅增加15.1%,提示损伤的肠上皮对MSC具有更强的趋化作用,应进一步研究MSC在损伤肠道中的作用。移植早期BMDCs首先进入肠道固有层,并由底部向顶部逐渐迁移,不会进入肠上皮层。移植后1个月左右,BMDCs可完成对固有层的填充并开始分化为肠上皮细胞。7.细胞融合并非BMDCs形成骨髓来源肠上皮细胞的唯一机制使用雌性GFP小鼠骨髓移植给雄性C57小鼠,将GFP阳性作为供体细胞标志物,将Y染色体荧光原位杂交（Y-FISH）阳性作为受体细胞标志物。通过连续切片进行GFP和Y-FISH的共表达分析,我们发现GFP和Y-FISH双阳性的供体来源上皮细胞占全部骨髓来源上皮细胞的53.6%,而GFP单阳性的细胞占46.4%,两者之间相差不具显著性,说明细胞融合不是BMDCs形成肠上皮细胞的唯一机制。8.间质上皮转化（MET）是BMDCs形成肠上皮细胞的另一种机制供体骨髓来源肠上皮细胞主要分布于隐窝绒毛轴的绒毛部分,且呈散在不连续的分布状态,隐窝结构中很少观察到骨髓来源上皮细胞。增殖细胞核标记物Ki67阳性的BMDCs可以进入绒毛上皮当中,细胞多为圆形,位于上皮层的底部,少量位于上皮层上部。上皮层内约有23.6%的BMDCs为Ki67阳性,且存在有Ki67阳性的肠上皮细胞位于绒毛区内。这些结果说明增殖性BMDCs可以从间质内进入肠上皮当中,并在局部微环境的诱导下获取肠上皮细胞的形态和表型。9.MSC较HSC更容易诱导并呈现出肠上皮细胞表型将MSC和HSC分别加入到肠上皮细胞株IEC-6当中进行共培养,发现MSC在24小时即可检测到上皮细胞特异性粘附分子E-Cadherin的表达,共培养48hMSC呈细胞角蛋白PCK染色阳性；而HSC在共培养7d后E-Cadherin和PCK才呈阳性表达,提示MSC较HSC更容易分化为肠上皮细胞。10.MSC细胞可能通过间质上皮转化形成肠上皮细胞分离胎儿的骨髓进行原代培养,通过细胞形态、表面标记、细胞周期和诱导分化证实传代至第10代的细胞具有良好的MSC细胞特性。使用胎儿骨髓MSC和肠上皮细胞株IEC-6进行共培养,发现肠上皮细胞能够促进hMSC增殖。正常hMSC不表达E-Cadherin,共培养3d后E-Cadhein表达水平增加6.46倍,7d后E-Cadherin增加7.66倍；而肠上皮特异性细胞角蛋白Krt20在共培养3d时表达增加3.77倍,7d时增加6.38倍。这些结果提示共培养时hMSC可能是通过高表达E-Cadherin来启动间质上皮转化过程,进而逐渐表达Krt20使得hMSC获取肠上皮细胞表型。
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