大白菜BAC文库的鉴定以及开花相关基因FLC1的筛选

论文摘要

细菌人工染色体（BAC）文库是基因组研究中最方便、最可靠、应用最广的文库,已成为现在基因组学研究的重要工具。BAC文库在基因的染色体物理定位、物理图谱构建、比较基因组研究、基因的图位克隆、基因组测序等方面发挥着重要的作用。大白菜BAC文库的构建和特异克隆筛选为利用BAC-FISH技术为准确鉴别每个染色体、基因定位和筛选优良的功能基因以及开展芸薹属A基因组与其他基因组比较研究奠定了基础。本研究以已经构建的大白菜‘85-1’BAC文库为基础,对200个随机挑取的阳性克隆质粒进行NotI酶切,通过脉冲场电泳结果计算文库克隆的平均插入片段、覆盖率、空载率,随机挑取的6个BAC克隆进行连续5天（0100代）的培养,对质粒进行HindⅢ酶切,分析克隆稳定性。采用改良的混合池构建方法,构建了大白菜BAC文库一级、二级混合池。利用开花相关基因FLC1特异引物对该文库进行PCR筛选,获得包含开花相关基因FLC1同源序列的BAC克隆。本试验的研究结果如下: 1.大白菜文库含有57 000个克隆,以基因组大小为550Mbp计算覆盖大白菜基因组10.4倍,预计从文库中筛选到单拷贝基因的机率为99.996%。2.随机挑取200个阳性克隆检测得知,文库插入片段的平均大小为98.4kb,空载率为1.5%;文库中80%克隆在90110kb之间,文库片段大小比较集中,这样大小的插入可以满足所有试验对插入片段大小的要求。3.脉冲电泳图谱表明,没有重排现象,大白菜BAC克隆培养5天后依然是稳定的。这些指标表明此大白菜文库是一个高质量、高覆盖率的文库,能有效的用于目的基因的分离。4.对PCR的筛选方法作了改进,对二级混合池只构建行的混合池,与传统方法相比,省去列池构建,贮存混合池占用空间减小,既减少了PCR的次数,又减少了对384孔板的污染几率,使得程序简化。5.利用三步PCR的筛选,通过50个一级混合池、16个二级混合池、48个单克隆的PCR筛选,共114 PCR反应获得2个FLC1的BAC克隆。克隆测序结果表明,其扩增产物的序列与BrFLC1的相似性达到99%,证实此克隆为含FLC1同源序列的BAC克隆。FLC1同源序列BAC克隆的获得为进一步研究大白菜开花基因的功能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 BAC 文库在大片断文库中的优点
• 1.2 BAC 文库的应用
• 1.2.1 BAC 文库在基因图位克隆上的应用
• 1.2.2 BAC 文库在基因组测序上的应用
• 1.2.3 BAC 文库在转基因上的应用
• 1.2.4 BAC 文库在比较基因组学上的应用
• 1.2.5 BAC 克隆与FISH 相结合的应用
• 1.3 BAC 文库的鉴定
• 1.3.1 插入片断大小的鉴定
• 1.3.2 覆盖率大小的鉴定
• 1.3.3 空载率的鉴定
• 1.3.4 稳定性的鉴定
• 1.3.5 污染率的鉴定
• 1.4 BAC 文库的筛选方法
• 1.4.1 尼龙膜杂交筛选方法
• 1.4.2 PCR 筛选方法
• 1.4.3 膜杂交筛选方法与PCR 筛选方法的优缺点
• 1.5 开花相关基因FLC 的研究进展
• 1.5.1 FLC 基因的表达调控
• 1.5.2 芸薹属中的FLC 基因
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 主要的仪器设备及耗材
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 BAC 克隆插入片段大小及空载率的检测
• 2.2.2 BAC 克隆稳定性鉴定
• 2.2.3 开花基因引物设计
• 2.2.4 一级混合池的构建及阳性克隆的筛选
• 2.2.5 二级混合池的构建及阳性克隆的筛选
• 2.2.6 大白菜FLC1 单克隆的筛选
• 2.2.7 FLC1 PCR 产物的回收、转化
• 2.2.8 BAC 克隆PCR 产物测序及分析
• 3 结果与分析
• 3.1 BAC 克隆插入片段大小及空载率的检测
• 3.2 插入片段稳定性的检测
• 3.3 大白菜FLC1 基因BAC 克隆的筛选
• 3.4 FLC1 单克隆的鉴定及序列分析
• 4 讨论
• 4.1 大白菜BAC 文库的质量鉴定
• 4.2 PCR 方法筛选文库
• 4.3 大白菜FLC1 基因的应用
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢