论文摘要
Recombineering（重组工程）是近年来兴起的一项新型基因操作技术。与传统的遗传工程技术相比,重组工程不需要限制酶和连接酶,仅需要用PCR方法合成线性DNA打靶分子,在大肠杆菌体內的噬菌体重组酶作用下,对大肠杆菌染色体DNA或者携带大分子基因组DNA序列的BAC/PAC质粒进行精确的修饰。该项技术为基因功能研究以及细菌遗传学和疫苗研究开辟了另人激动的新技术途径。 本研究用Gap-repair体内亚克隆的方法,将λ噬菌体左向操纵子中自exo到cI857长约6.7kb的DNA片断克隆到低拷贝质粒pACYC184中,构建了一种新型、高效的重组工程系统pYM-Red。该系统保留了λ噬菌体Red重组酶受严谨调控的特点,又可以在不同的宿主菌间转移,应用范围比较广泛。pYM-Red的重组效率比pBR322-Red和pKD46分别高5～6倍。 为了探讨Red重组酶基因调控与功能的关系,用单链DNA重组方法,对DY330染色体PL操纵子上的DNA序列进行了逐段缺失,建立了3个突变体菌株。与原始DY330菌株相比,这3个突变体的重组效率均有所下降。为了提高重组效率,进一步用Gap-repair的方法将PL操纵子中的TL3转录终止子序列敲入Red重组酶基因的下游,构建了一个新的重组质粒:pYM-RedT。结果表明,pYM-RedT比pYM-Red质粒的重组效率又提高了约2倍。 为了探索Red重组酶基因表达量对体内同源重组效率的影响,构建了exo基因的原核表达重组质粒pGEX4T1-Exo和pET28a-Exo。在BL21菌株中表达并纯化了Exo融合蛋白,制备了Exo蛋白的多克隆抗体并对抗体的效价进行了ELISA检测。用Western方法检测了不同诱导时间条件下的Exo蛋白的表达量,结果表明,重组效率随诱导时间的延长和Exo的表达量上升而下降。提示准确掌握诱导Red重组酶基因表达的条件对提高重组效率至关重要。