嗜热毛壳菌热稳定几丁质酶基因的克隆、表达与性质研究

论文摘要

几丁质是地球上含量仅次于纤维素、位居第二的碳水化合物,而真菌所分泌的几丁质酶可将几丁质水解,最终产物为N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（N-Acetyl-β-D-Glucosamine,NAG）。由于采用传统化学方法降解几丁质耗时、难度大、成本高、污染严重,而采用生物降解不仅有效克服了上述问题,还可提高资源利用、增加经济效益,因此被广泛应用在农业、医药、化工、食品、环境等诸多领域。尽管已经分离了许多种几丁质酶,相关的基因也已克隆和表达,但有关热稳定性几丁质酶的研究却很少。目前仅从极端耐热古细菌Thermococcus chitonophagus、Thermococcus kodakaraensis KOD1以及细菌Bacillus BG-11、Streptomyces OPC520等中分离到热稳定几丁质酶基因,而真菌中除了本实验室报道的来源于嗜热真菌疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）的热稳定几丁质酶基因外,未见其它报道。嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）广泛分布,生长上限温度较高,从该真菌中已分离得到多种嗜热酶,但未见嗜热几丁质酶的报道。本研究中C. thermophilum在以胶状几丁质为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了胞内几丁质酶。根据真菌几丁质酶的氨基酸同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端（RACE）的方法,克隆了嗜热毛壳菌C. thermophilum热稳定几丁质酶chit基因,cDNA序列全长为1209bp,包含一个开放阅读框,编码402个氨基酸。该基因已在Genbank中注册,登录号为EU697741。同时提取出嗜热毛壳菌C. thermophilum基因组DNA,克隆了该酶的部分DNA序列,获得的序列长1263bp,包含一个内含子区域。该基因在GenBank中注册号为EU697742。由核苷酸序列推测的相应氨基酸序列结构包括催化区,无N端信号肽序列、几丁质结合区和富含丝苏氨酸区。比较几丁质酶的催化区序列,发现与18家族几丁质酶的催化区同源性很高,其中两个基序S-GGW和DG-D-DWE非常保守,这两保守基序与糖基水解酶（glycosylhydrolases）18家族催化活性有关,其中不变氨基酸残基Asp和Glu为几丁质酶的催化活性位点,因此该酶应属于几丁质酶18家族。还利用在线软件预测了该蛋白质的糖基化位点和三级结构。并对该基因的系统发育作了初步分析。将chit基因与酵母表达载体pPIC9K经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,体外连接构建了酵母分泌型表达载体pPIC9K/chit,将重组表达质粒pPIC9K/chit和pPIC9K空质粒分别用限制性内切酶SacⅠ（位于5’AOX1区内）线性化后,采用电击法转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115感受态细胞,于MD/MM平板上筛选His+Mut+表型的酵母转化子。经过PCR检测及G418抗性筛选多拷贝整合子,进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子每隔24h的蛋白表达情况来筛选高效表达目的几丁质酶的工程菌株。经过检测与筛选获得了转酵母工程菌株GS-CH-4,检测遗传稳定性,并测定了几丁质酶CHIT的酶学性质。酵母工程菌株GS-CH-4在YPD平板上划线,连续传代8次后,PCR检测呈阳性,重组几丁质酶的表达量基本保持稳定。表达几丁质酶CHIT的最适反应温度和pH分别为60℃和5.5,该酶在50℃以下稳定;65℃的半衰期为40min,由此可见该表达几丁质酶具有热稳定性,且在pH值为2.0～6.0之间表达几丁质酶保持稳定的酶活性;Ba2+、Fe2+对酶有激活作用,一些重金属离子Ag+、Hg2+对酶有显著的抑制作用。C. thermophilum几丁质酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白,而且表达产物具有优良特性,这就预示了表达几丁质酶在几丁质工业和生物学领域的广阔应用前景。因此,期望能对该基因进行改造,或进一步优化表达条件,获得真正有工业应用价值的酵母工程菌株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词及中文对照表
• 第一章 文献综述
• 引言
• 1. 几丁质酶的研究进展
• 1.1 几丁质酶系组成
• 1.2 几丁质酶的分子结构
• 1.2.1 信号肽序列
• 1.2.2 催化域
• 1.2.3 几丁质结合区（CHBD）
• 1.2.4 富含Ser/Thr 区和C 端序列
• 1.3 几丁质酶的性质
• 1.4 产几丁质酶的微生物
• 1.5 几丁质酶基因克隆
• 1.6 几丁质酶基因的表达调控
• 1.7 几丁质酶基因的表达转化
• 1.8 几丁质酶基因的应用
• 1.8.1 几丁质酶降解产物的应用
• 1.8.2 在生物防治中的应用
• 1.8.2.1 用于植物病原真菌的生物防治
• 1.8.2.2 用于抗病基因工程
• 1.8.3 在调节生命代谢活动中的应用
• 1.8.4 在生物学研究方面的应用
• 2. 本研究的目的和内容
• 2.1 研究目的和意义
• 2.2 研究内容
• 2.3 技术路线
• 第二章 嗜热毛壳菌热稳定几丁质酶基因的克隆及序列分析
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 菌株与质粒
• 1.1.3 酶和生化试剂
• 1.1.4 仪器
• 1.1.5 培养基
• 1.1.6 溶液配制
• 1.2 嗜热毛壳菌CT2 几丁质酶基因的cDNA 克隆
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 总RNA 的提取（ Trizol 法）
• 1.2.3 反转录cDNA 第一链的合成
• 1.2.4 目的基因cDNA 中间片段的分离
• 1.2.4.1 目的基因cDNA 中间片段的扩增
• 1.2.4.2 PCR 产物回收
• 1.2.4.3 与载体连接
• 1.2.4.4 E.coli 感受态细胞的制备和转化
• 1.2.4.4.1 大肠杆菌感受态的制备
• 1.2.4.4.2 大肠杆菌感受态的转化
• 1.2.4.5 重组质粒的筛选与鉴定
• 1.2.4.5.1 IPTG-X-gal 筛选
• 1.2.4.5.2 菌落PCR 检测
• 1.2.4.5.3 碱法小量提取质粒DNA
• 1.2.4.5.4 质粒DNA 的酶切鉴定
• 1.2.4.6 序列测定
• 1.2.5 嗜热毛壳菌几丁质酶基因3’末端的分离（3’-RACE）
• 1.2.6 嗜热毛壳菌几丁质酶基因5’末端的分离（5’-RACE）
• 1.2.6.1 cDNA 第一链的合成
• 1.2.6.2 cDNA 第一链的纯化
• 1.2.6.3 cDNA 第一链的加尾
• 1.2.6.4 RACE-PCR 扩增
• 1.2.6.5 二次PCR（巢式PCR）
• 1.2.7 目的基因全长cDNA 的克隆
• 1.2.8 全长序列的生物信息学分析
• 1.3 嗜热毛壳菌几丁质酶基因DNA 的克隆及序列分析
• 1.3.1 菌丝体DNA 的抽提（CTAB 法）
• 1.3.2 嗜热毛壳菌几丁质酶基因DNA 的PCR 扩增
• 1.3.3 嗜热毛壳菌几丁质酶基因DNA 的序列分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 嗜热毛壳菌总RNA 的提取
• 2.2 嗜热毛壳菌几丁质酶基因cDNA 的分离
• 2.2.1 C. thermophilum 几丁质酶基因cDNA 中间片段的分离
• 2.2.2 C. thermophilum 几丁质酶基因cDNA3’末端的分离及序列分析
• 2.2.3 C. thermophilum 几丁质酶基因cDNA 5’末端的分离
• 2.2.4 C. thermophilum几丁质酶基因全长cDNA 的分离及扩增片段的序列拼接
• 2.2.5 C. thermophilum 几丁质酶基因的cDNA 和氨基酸序列分析
• 2.2.5.1 C. thermophilum 几丁质酶基因的cDNA 序列分析
• 2.2.5.2 C. thermophilum 几丁质酶基因的氨基酸序列分析
• 2.2.5.3 C. thermophilum 几丁质酶基因的结构预测
• 2.2.5.3.1 C. thermophilum 几丁质酶基因的跨膜区预测
• 2.2.5.3.2 C. thermophilum 几丁质酶基因的三级结构预测
• 2.3 C. thermophilum 几丁质酶基因DNA 的扩增
• 2.3.1 C. thermophilum 几丁质酶DNA 基因序列分析
• 2.3.2 C. thermophilum 几丁质酶DNA 基因的核苷酸序列分析
• 3 讨论
• 3.1 小结
• 3.2 基因分离技术
• 3.2.1 菌丝总RNA 的提取
• 3.2.2 PCR 引物设计
• 3.2.3 分离基因的技术
• 3.2.3.1 RACE 技术
• 3.2.3.2 热不对称交错PCR（TAIL-PCR）
• 3.3 后续工作的展望
• 第三章 嗜热毛壳菌几丁质酶基因在毕赤酵母中的表达
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 酶和生化试剂
• 1.1.3 培养基及有关溶液的配制
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 Chaetomium thermophilum 几丁质酶成熟肽基因序列的分离
• 1.2.1.1 C. thermophilum 几丁质酶成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析
• 1.2.1.2 引物设计和C. thermophilum 几丁质酶成熟肽基因序列的分离
• 1.2.2 几丁质酶基因在毕赤酵母中的表达
• 1.2.2.1 酵母表达载体的构建
• 1.2.2.2 线性化质粒DNA 的制备
• 1.2.2.2.1 线性化酶切
• 1.2.2.2.2 线状质粒DNA 的脱磷酸化处理
• 1.2.2.3 酵母转化
• 1.2.2.3.1 Pichia pastoris G5115 感受态细胞的制备（电击法）
• 1.2.2.3.2 重组表达质粒pPIC9K
• 1.2.2.4 酵母转化子的筛选与鉴定
• 1.2.2.4.1 酵母转化子甲醇利用表型的平板筛选
• 1.2.2.4.2 酵母基因组DNA 的分离
• 1.2.2.5 酵母转化子的PCR 鉴定
• 1.2.2.5.1 pPIC9K AOX1 通用引物鉴定
• 1.2.2.5.2 chit 基因的特异性引物鉴定
• 1.2.2.6 外源基因多拷贝整合转化子筛选
• 1.2.2.7 酵母工程菌的培养和几丁质酶的诱导分泌表达
• 1.2.2.8 表达产物的分离纯化
• 1.2.2.8.1 粗酶液的制备
• 1.2.2.8.2 硫酸铵沉淀
• 1.2.2.8.3 DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析
• 1.2.3 蛋白质含量测定
• 1.2.3.1 标准曲线的绘制
• 1.2.3.1.1 0-100μg/mL 标准曲线的制作
• 1.2.3.1.2 0-1000μg/mL 标准曲线的制作
• 1.2.3.1.3 考马斯亮蓝G-250 试剂的配制
• 1.2.3.1.4 样品蛋白质浓度的测定
• 1.2.4 蛋白质纯度鉴定
• 1.2.4.1 电泳操作步骤
• 1.2.5 蛋白质分子量的测定
• 1.2.5.1 SDS-PAGE 法测定蛋白质分子量
• 1.2.5.1.1 凝胶电泳方法参照《生物化学实验技术》进行
• 1.2.5.1.2 电泳迁移率的计算和标准曲线的制作
• 1.2.5.1.3 分子量测定
• 1.2.5.2 凝胶过滤层析法
• 1.2.6 几丁质酶表达产物的生物学活性检测
• 1.2.6.1 N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）标准曲线的建立
• 1.2.6.2 表达产物几丁质酶的SDS-PAGE 分析
• 1.2.7 几丁质酶工程菌产酶曲线的测定
• 1.2.8 几丁质酶工程菌的遗传稳定性分析
• 1.2.9 几丁质酶工程菌表达产物的酶学性质
• 1.2.9.1 反应最适温度
• 1.2.9.2 反应最适pH 值
• 1.2.9.3 热稳定性
• 1.2.9.4 pH 值稳定性
• 1.2.9.5 不同金属离子对几丁质酶活性的影响
• 1.2.9.6 几种变性剂和蛋白抑制剂对几丁质酶活性的影响
• 2. 结果与分析
• 2.1 C. thermophilum 几丁质酶成熟肽基因序列的分离
• 2.1.1 C. thermophilum 几丁质酶成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析结果
• 2.1.2 C. thermophilum 几丁质酶成熟肽基因序列的分离
• 2.2 C. thermophilum 几丁质酶基因chit 在毕赤酵母中的表达
• 2.2.1 酵母表达载体的构建和鉴定
• 2.2.2 重组酵母表达质粒pPIC9K/chit转化Pichia pastoris GS115及酵母转化子的筛选
• 2.2.2.1 酵母转化子的甲醇利用表型的筛选
• 2.2.2.2 酵母转化子的PCR 鉴定
• 2.2.2.3 chit 基因多拷贝整合子的筛选
• 2.2.3 C. thermophilum 几丁质酶chit 基因在Pichia pastoris 中的高效表达及表达产物的检测
• 2.2.3.1 C. thermophilum 几丁质酶chit 基因在Pichia pastoris 中的诱导表达和高表达酵母菌株的筛选
• 2.2.3.2 C. thermophilum 几丁质酶酵母工程菌产酶曲线的测定
• 2.2.3.3 C. thermophilum 几丁质酶基因表达产物的SDS-PAGE 检测
• 2.2.4 C. thermophilum 几丁质酶酵母工程菌的遗传稳定性分析
• 2.2.5 表达几丁质酶CHIT 的纯化与酶学性质研究
• 2.2.5.1 表达几丁质酶CHIT 的纯化
• 2.2.5.1.1 DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析
• 2.2.5.2 表达产物几丁质酶CHIT 的最适反应温度
• 2.2.5.3 表达产物几丁质酶CHIT 的最适反应pH 值
• 2.2.5.4 表达产物几丁质酶CHIT 的热稳定性
• 2.2.5.5 表达产物几丁质酶CHIT 的pH 稳定性
• 2.2.5.6 金属离子对表达产物几丁质酶CHIT 活性的影响
• 2.2.5.7 变性剂和蛋白酶抑制剂对表达产物几丁质酶CHIT 几丁质酶活性的影响
• 3 讨论
• 3.1 小结
• 3.2 表达重组几丁质酶的Pichia pastoris 表达系统评析
• 3.2.1 巴斯德毕赤酵母表达系统高效表达重组几丁质酶的优势
• 3.2.2 影响Pichia pastoris 表达系统表达重组几丁质酶的因素..
• 3.2.3 摇瓶培养与发酵罐培养
• 3.3 后续工作展望
• 第四章 结论和展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢