核成熟抑制剂对猪卵母细胞体外成熟和发育能力的影响

论文摘要

通过对比不同猪卵母细胞体外成熟培养液和添加不同的小分子化合物,研究猪卵母细胞体外成熟情况,优化猪卵母细胞体外成熟培养体系。论文主要从以下2个方面进行了研究:1、猪卵母细胞体外成熟培养体系的优化人用卵母细胞体外成熟培养液ART-1600和常用的猪卵母细胞体外成熟培养液mM199、NCSU-23对猪卵母细胞体外成熟的影响进行了比较,并对比了成熟卵母细胞孤雌激活后发育能力的变化;通过添加10%PFF和不同浓度的BSA来优化猪卵母细胞体外培养体系;还比较了三种猪体外胚胎培养液（PZM-3、NCSU-23和G1/G2）对孤雌胚胎体外发育的影响。研究结果发现:（1）猪卵母细胞体外成熟时,ART-1600组卵母细胞的成熟率显著高于mM199和NCSU-23两种培养液（P<0.05,81.6 %±4.9 % vs 71.7 %±3.2 %、69.6 %±3.9 %）;ART-1600组成熟的卵母细胞,经孤雌激活后的囊胚率显著高于mM199和NCSU-23组（P<0.05,22.6 %±3.8 %vs 18.7 %±1.2 %、17.7 %±1.9 %）;（2）添加10% PFF组与对照组相比成熟率无显著差异（P>0.05）,但能显著提高孤雌激活后胚胎的卵裂率（P<0.05）;（3）在成熟培养液中分别添加0、1.5、3、6和12mg/mL BSA,发现3 mg/mL BSA虽不能提高卵母细胞的成熟率（P>0.05）,但能显著提高孤雌激活后胚胎的卵裂率（P<0.05）,而对囊胚率无显著影响（P>0.05）。还发现≥6 mg/mL BSA时卵母细胞的成熟率显著降低（P<0.01）,并且有大量卵母细胞退化死亡;（4）微滴并覆盖矿物油培养卵母细胞与四孔板培养相比,成熟率无显著差异（P>0.05）,但前者成熟的卵母细胞胞质并无收缩;（5）孤雌胚胎体外培养时,PZM-3组的胚胎卵裂率和囊胚率均好于NCSU23组和G1/G2组,且差异显著（P<0.01,77.0 %±3.9 % vs 63.9 %±4.2 %、63.6 %±8.3 %,19.0 %±0.3 % vs 13.2 %±1.1 %、10.9 %±1.2 %）。结果表明ART-1600作为猪卵母细胞体外成熟培养液好于mM199和NCSU-23,在成熟培养液中添加10% PFF和3 mg/mL BSA能够提高卵母细胞激活后的发育能力,PZM-3作为猪孤雌胚胎体外培养液好于NCSU-23和G1/G2。2、丁内酯-I对卵母细胞成熟及胚胎发育能力的影响对cdc2激酶抑制剂丁内酯-I（butyrolactone I, BL-I）对猪卵母细胞体外成熟的抑制情况,以及抑制后卵母细胞发育能力进行了研究。结果表明,分别用0、10、20、40和80μmol/L BL-I处理猪卵母细胞44h后,对卵母细胞成熟的抑制程度与BL-I浓度的升高成正比。用20、40和80μmol/L处理时,处于GV期的卵母细胞分别为25%、47%和67%,与对照组（5%）相比差异极显著（P<0.01）;而到达MⅡ期的卵母细胞分别为38%、9%和0,与对照组（67%）相比差异极显著（P<0.01）,说明BL-I对卵母细胞成熟有明显抑制作用。将20、40和80μmol/Lol/L处理的卵母细胞,再在正常培养液中培养44h后,到达MⅡ期的卵母细胞为57%、41%和5%,与抑制44h时相比均有显著提高,表明BL-I对卵母细胞成熟的抑制作用是可逆的。20μmol/L BL-I抑制培养20h再正常培养24h（20h+24h处理组）后卵母细胞的成熟率显著低于对照组（正常培养44h）（P<0.05, 65.6 % vs 70.1%）。并对20h+24h处理组成熟的卵母细胞进行孤雌激活,其卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数与对照组均无显著差异;对20h+24h处理组成熟的卵母细胞进行核移植（NT）,获得重构胚的卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数均优于对照组,但仅卵裂率有显著差异（P<0.05, 68.9 % vs 62.4%）;表明经BL-I处理能够提高猪卵母细胞孤雌和NT胚胎发育能力。

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摘要

ABSTRACT

文献综述

第一章猪卵母细胞体外成熟的研究

1.1 猪卵母细胞体外成熟

1.2 猪卵母细胞体外成熟机制

1.2.1 卵母细胞的发生及其减数分裂的恢复

1.2.2 卵母细胞成熟过程中的调控机制

1.3 影响猪卵母细胞体外成熟的因素

1.3.1 猪的品种、年龄及健康状态

1.3.2 卵巢的离体时间及保存温度

1.3.3 卵巢质量及卵泡的大小

1.3.4 卵丘细胞与卵母细胞IVM 的关系

1.3.5 卵母细胞的采集方法

1.3.6 猪卵母细胞IVM 的基础培养液

1.3.7 猪卵母细胞体外成熟液中的添加物

1.3.8 卵母细胞体外成熟的培养环境

1.3.9 卵母细胞体外成熟的培养时间

1.4 猪卵母细胞体外成熟存在的问题

1.5 提高猪卵母细胞体外成熟效率的意义

第二章猪卵母细胞核成熟抑制剂的研究

2.1 卵母细胞体外成熟常用的抑制剂种类

2.2 卵母细胞核成熟抑制剂的作用机理

2.2.1 蛋白合成抑制剂

2.2.2 cAMP 相关抑制剂

2.2.3 蛋白激酶磷酸化抑制剂

2.2.4 生理性抑制剂

2.3 抑制剂对卵母细胞成熟的影响

2.3.1 抑制剂对卵母细胞减数分裂恢复的影响

2.3.2 抑制剂对卵丘细胞扩散的影响

2.4 添加抑制剂的意义

2.5 抑制剂使用存在的问题

试验研究

第三章猪卵母细胞体外成熟培养体系的优化

3.1 材料和方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 试验设计

3.2.1 不同培养基对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响

3.2.2 PFF 对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

3.2.3 BSA 浓度对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

3.2.4 不同培养方法对猪卵母细胞体外成熟的影响

3.2.5 不同胚胎培养液对孤雌胚胎发育的影响

3.2.6 数据处理

3.3 结果

3.3.1 不同培养基对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响

3.3.2 PFF 对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

3.3.3 BSA 浓度对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

3.3.4 不同培养方法对猪卵母细胞体外成熟的影响

3.3.5 不同胚胎培养液对孤雌胚胎发育的影响

3.4 讨论

3.5 小结

第四章丁内酯-I 对卵母细胞成熟及胚胎发育能力的影响

4.1 材料和方法

4.1.1 材料

4.1.2 方法

4.2 试验设计

4.2.1 BL-I 浓度对卵母细胞核成熟的抑制作用

4.2.2 不同浓度的BL-I 抑制后卵母细胞核成熟的恢复情况

+/20h+BL-I^-/24h 对卵母细胞成熟的影响'>4.2.3 20μmol/L 处理BL-I⁺/20h+BL-I^-/24h 对卵母细胞成熟的影响

4.2.4 经20h+24h 处理后成熟卵母细胞孤雌激活发育能力

4.2.5 经20h+24h 处理后成熟卵母细胞NT 胚胎的发育能力

4.2.6 数据处理

4.3 结果

4.3.1 BL-I 浓度对卵母细胞核成熟的抑制作用

4.3.2 不同浓度的BL-I 抑制后卵母细胞核成熟的恢复情况

+/20h+BL-I^-/24h 对卵母细胞成熟的影响'>4.3.3 20μmol/L 处理BL-I⁺/20h+BL-I^-/24h 对卵母细胞成熟的影响

++24h^-处理后成熟卵母细胞孤雌激活发育能力'>4.3.4 经20h⁺+24h^-处理后成熟卵母细胞孤雌激活发育能力

++24h^-处理后成熟卵母细胞NT 胚胎的发育能力'>4.3.5 经20h⁺+24h^-处理后成熟卵母细胞NT 胚胎的发育能力

4.4 讨论

4.5 小结

结论

论文创新点

参考文献

缩略词表

致谢

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