论文摘要
持续性不卧床腹膜透析（Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis,CAPD）是终末期肾脏病（end stage renal disease,ESRD）的替代治疗方法之一。然而,腹膜透析相关性腹膜炎是腹膜透析主要并发症,是技术失败的主要原因。研究显示低钾在腹膜透析患者中发生率在10%-36%不等,老年患者中的发生率可高达55.6%。近年研究提示低钾是腹膜透析相关性腹膜炎发生的危险因子之一。电压门控性钾通道1.3（voltage-gated potassium channel 1.3,Kvl.3）是钾离子进出细胞的主要途径之一。Kvl.3在自身免疫性疾病淋巴细胞表达异常,选择性阻滞钾通道,可以有效减轻或延缓疾病的发生发展。那么,作为腹腔局部防御中的主要细胞群---腹腔巨噬细胞,其Kv1.3在腹膜透析相关性腹膜炎中表达是否发生变化?低钾血症是否影响腹腔巨噬细胞表面Kv1.3的表达?低钾是否影响巨噬细胞功能?目前相关研究报道甚少。本研究拟从体内外水平探讨低钾和腹腔巨噬细胞Kv1.3表达在腹膜透析相关性腹膜炎发生中的可能作用。第一部分腹膜透析相关腹膜炎患者血钾及腹腔巨噬细胞Kv1.3表达变化研究一、目的探讨腹膜透析相关性腹膜炎志者血钾及腹腔巨噬细胞Kv1.3的表达变化及其临床意义二、方法本研究为横断面研究,收集2010年3月至2010年8月的中山大学附属第一医院腹膜透析中心CAPD相关性腹膜炎患者32例。腹膜炎诊断标准参照2005年国际腹膜透析协会推荐指南。另收集55例CAPD无腹膜炎患者作为对照,记录患者人口学及血钾等实验室常规检查数据。流式细胞仪检测透出液中巨噬细胞表面Kv1.3。三、结果对照组和腹膜炎组患者平均年龄分别为49.9±14.9岁和51.7±15.3岁,男女比例分别为37：18和17：15,糖尿病肾病分别占24%和19%。对照组和腹膜炎组腹膜透析月分别为23.50±44.70和17.8±23.7。腹膜炎患者外周血白细胞、中性粒细胞百分比水平、红细胞、血红蛋白水平显著高于对照组（P<0.01或P<0.05）,两组血清白蛋白差异无统计学意义。低血钾主要发生在低白蛋白血症、低尿素氮等营养不良志者和长透析龄志者；未发现血钾与腹腔巨噬细胞Kv1.3的表达有相关性。与对照组比较,透出液巨噬细胞Kvl.3表达无统计学差异（平均荧光强度9.54±3.61 vs.8.78±2.30,P>0.05）。四、结论腹透相关性腹膜炎患者血钾水平显著下降,透出液巨噬细胞Kv1.3表达与非腹膜炎志者比较无显著改变。这一结果提示低钾参与腹透相关性腹膜炎的发生。然而低钾患者是否对腹膜炎增加易感性值得进一步随访观察。此外腹膜炎时是否外周血单个核细胞存在K.v1.3相关的免疫异常值得进一步研究。第二部分低钾对巨噬细胞功能影响的研究一、目的探讨低钾对巨噬细胞功能的影响二、方法小鼠巨噬细胞株Raw264.7常规培养,观察不同浓度钾培养基（5.4mM、2mmM、4mM和10mM）对巨噬细胞活力（LDH不flAnnex in V-FITC凋亡检测）、吞噬功能（吞噬中性红及Alexa fluxa（?）488-E.coli）、杀菌能力（菌落形成单位杀菌实验）以及分泌炎性介质NO、IL-6和TNF-α的影响（流式细胞仪检测细胞内因子及ELISA）。三、结果1.不同浓度钾培养基对巨噬细胞活力的影响：1.1不同浓度钾培养基作用细胞不同时间培养上清乳酸脱氢酶（LDH）浓度变化：4h 5.4mmM钾浓度（生理钾浓度）组、2mmM钾浓度组、4mmM钾浓度组、10mmM钾浓度组LDH分别为：6.47±0.27 U/L、6.55±0.16 U/L、6.33±0.52 U/L、6.54±0.18 U/L、；8h 5.4mM钾浓度（生理钾浓度）组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组、10mmM钾浓度组LDH分别为：7.1850.84 U/L、7.34±0.32U/L、7.51±0.27U/L、7.73±0.22 U/L；12h 5.4mM钾浓度（生理钾浓度）组、2mmM钾浓度组、4mM钾浓度组、10mM钾浓度组LDH分别为：14.84±2.07 U/L、15.00±1.58 U/L、14.57±2.4 U/L 4、14.23±1.95 U/L；24h 5.4mmM钾浓度（生理钾浓度）组、2mmM钾浓度组、4mmM钾浓度组、10mM钾浓度组LDH分别为：19.62±3.52 UL、17.93±2.20 U/L、18.45±2.39 U/L、20.61±3.36 U/L；以上各时间点不同钾浓度组间LDH水平均无显著性差异。1.2对细胞凋亡的影响：不同浓度钾培养基作用4h,5.4mM钾浓度（生理钾浓度）组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组、10mM钾浓度组细胞存活率分别为：95.49%±2.98%、96.00%±2.97%、95.51%±2.06%、96.79%±3.75%,各组之间无显著性差异；8h 5.4mM（生理钾浓度）组、2mmM钾浓度组、4mM钾浓度组、10mM钾浓度组存活率分别为：93.20%±3.81%、92.40%±5.65%、92.90%±7.83%、93.70%±6.01%,各组间无显著性差异；12h 5.4mmM（生理钾浓度）组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组、1 0mM钾浓度组细胞存活率分别为：91.90%±3.09%、87.76%±4.84%、89.20%±3.82%、93.94%±2.93%,与对照组比较,2mmM钾浓度组细胞存活率显著下降（P<0.05）；与1OmM钾浓度组比较,2mM钾浓度组和4mM钾浓度组细胞存活率均显著下降（P<0.01）；24h 5.4mM（生理钾浓度）组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组、1 0mM钾浓度组细胞存活率分别为：88.74±2.72%、80.49%±1.67%；79.35%±9.58%、89.30%±5.77%,与对照组和10mM钾浓度组比较,4mM钾浓度组细胞存活率明显下降（P<0.05）。2.不同浓度钾培养基对巨噬细胞吞噬中性红的影响：不同浓度钾培养基作用4h,5.4mM钾浓度（生理钾浓度）组、2mM钾浓度组、4mmM钾浓度组、10mM钾浓度组细胞中性红吸光度值分别为：0.21±0.02、0.15±0.01、0.19±0.01、0.22±0.01。2mM钾浓度组显著低于其他各组（P<0.01）,4mM钾浓度组显著低于10mM钾浓度组（P<0.01）。3.不同浓度钾培养基对巨噬细胞吞噬荧光细菌功能的影响：不同浓度钾培养基预刺激4h,5.4mmM钾浓度（生理钾浓度）组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组和10mM钾浓度组巨噬细胞吞噬率分别为0.61±0.10、0.49±0.12、0.55±0.12和0.66±0.11。与对照组比较,10mM钾浓度组吞噬率显著升高（P<0.05）,吞噬指数分别为2.56±0.63、1.90±0.30、2.35±0.70、2.80±0.61；与10mM钾浓度组比较,2mM钾浓度组吞噬指数显著下降（P<0.01）。4.不同浓度钾培养基对巨噬细胞杀菌功能的影响：5.4mmM钾浓度（生理钾浓度）组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组和10mM钾浓度组吞噬细菌30min CFU分别为：18.89±6.72×104、10.56±1.8×x104、13.31±6.50×104、27.23±9.24×104；各组孵育前后CFU差值为：12.92±5.32×104、5.64±2.53×104、9.42±7.05×104、17.64±5.64×104。与对照组比较,2mmM钾浓度组吞噬细菌数及杀菌数减少显著（P<0.05）；与10mM钾浓度组比较,2mmM钾浓度组和4mmM钾浓度组吞噬钾菌数及杀菌数减少显著（P<0.01）。5.不同浓度钾培养基对巨噬细胞分泌炎性介质的影响：5.4mmM钾浓度（生理钾浓度）组、2mM钾浓度组、4mM钾浓度组和10mM钾浓度组NO水平分别为3.62±0.70μmol/L、3.69μ0.65μmol/L、4.01±1.5μmol/L、8.73±0.45μmol/L。与对照组比较,10mM钾浓度组NO水平著升高（P<0.01）,2mM钾浓度组和4mmM钾浓度组NO水平均无明显差异。与10mM钾浓度组比较,2mmM钾浓度组和4mmM钾浓度组NO水平显著低下（P<0.01或<0.05）。各组细胞IL-6浓度分别为：1.9±30.17pg/ml、0.30±0.23pg/ml、1.30±0.06pg/ml、2.42±0.13pg/ml。与对照组比较,2mM钾浓度组和4mM钾浓度组IL-6水平下降显著（P<0.01）、10mM钾浓度绁IL-6水平明显增高（P<0.01）,其余各组之间IL-6水平差异显著（P<0.01）；各组IL-6阳性细胞数百分比分别为：30.37±637、2137±2.23、27.83±3.34、33.85±3.85,2mmM钾浓度组低于4mM组,显著低于正常生理组和10mM组,4mmM组低于正常生理组和10mmM组；各组细胞TNF-α浓度分别为：308.43±196.05pg/ml、228.69±109.02pg/ml、227.66±111.79pg/ml、242.75±211.15pg/ml.与对照组比较,其余各组TNF-α浓度均下降,但是均无统计学差异；各组TNF-α阳性细胞百分比中值分别为98.65、97.70、97.3、97.23；正常生理组显著高于其他各组（P<0.05）。四、结论低钾显著降低巨噬细胞活力、吞噬功能、杀菌功能及分泌细胞因子的功能。全文总结1.腹透相关性腹膜炎志者血钾水平显著下降,透出液巨噬细胞Kv1.3表达与非腹膜炎患者比较无显著改变。提示低钾参与腹透相关性腹膜炎的发生。然而腹膜炎时是否外周血.单个核细胞存在Kv1.3相关的免疫异常值得进一步研究。2体外研究发现：细胞外低钾可显著抑制巨噬细胞吞噬杀菌及分泌炎性介质的功能；相反,细胞外高钾浓度可增强巨噬细胞抵御能力。
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