论文摘要
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis， Bt），革兰氏阳性细菌，在芽胞形成期可产生具有杀虫活性的伴胞晶体。Bt晶体主要由cry基因编码的杀虫晶体蛋白组成，在害虫的防治中具有重要作用，有巨大的商业价值，因此发掘新基因并进行知识产权保护是Bt资源研究的重要内容。知识产权作为综合竞争力的重要体现，而目前我国在Bt杀虫基因资源的知识产权方面处于劣势，大部分Bt杀虫基因的专利权掌握在西方各大型农业生物技术企业手中，我国掌握的Bt新的基因发明专利不足60项。高通量测序技术的发展为发掘杀虫基因提供了新思路，成为国内外发掘Bt杀虫基因的主要手段。但是测序价格较高，Bt资源库中存在的冗余菌株会造成较大的资金浪费，目前尚没有便捷的方法去除重复菌株。因此，迫切需要建立可以快速分析比较大量样品的方法，来排除重复菌株，进一步提高杀虫基因发掘效率。本论文在分离1500株Bt菌株的基础上，进一步建立了菌株多样性分析方法，对菌株多样性进行研究，去除冗余菌株，对其中90株菌株进行了杀虫基因测序筛选，主要结果如下：Bt菌株分离与鉴定：杀虫活性评估结果显示多数菌株对鳞翅目害虫有较高活性，1500株测试菌株中，对棉铃虫有活性的菌株有1346株，对玉米螟有活性菌株有813株，而对叶甲类害虫大猿叶甲有活性的菌株较少，只有42株；镜检结果显示不同菌株产生的晶体形状、大小、种类有较大差异，晶体种类主要为菱形，部分为球形和不规则的晶体形状；杀虫晶体蛋白图谱显示大部分菌株表达了130kD蛋白，部分菌株还表达了100Kd、60kD蛋白，具有典型Bt杀虫晶体蛋白的特征；质粒图谱显示不同菌株质粒图谱条带数量和大小都有所不同，并且有部分菌株图谱相似，说明资源库中有冗余菌株。建立Bt菌株多样性分析方法：首先，设计了可以扩增多个基因家族的兼并引物，fastPCR软件分析结果显示该引物可以对超过30种的杀虫基因家族进行较好的扩增，PCR实验检测显示，该引物可以扩增出预期条带但是条带较弱。进一步通过增加侧翼特异序列的办法对兼并引物进行改良，改良后的引物显著提高了扩增效率。同时，还对引物浓度与退火温度进行了优化，利用72个不同血清型的标准菌对优化后的PCR体系进行了评估，结果显示95%以上的菌株都可以获得预期条带；利用含有多个基因的HD12菌株评估了优化后体系对多个基因同时扩增的能力，结果显示优化后的PCR可以从HD12获得9种不同的RFLP类型。这些结果说明优化后的PCR体系具备了cry基因指纹图谱的基本要求。此外，本论文还对Bt基因组提取方法进行了改良，改良后的方法可以提取并获得质量均一的基因组DNA。用改良的PCR体系对Bt基因组进行扩增，并用HinfI对PCR产物进行消化，利用LabChip GX电泳系统进行分析，获得了888个菌株的RFLP图谱。进一步对电泳图谱进行数字化、计算相似性、构建系统发生树分析。结果显示，该方法可以有效分析菌株多样性，去除冗余菌株，获得可用于进一步基因发掘的菌株。90株Bt菌株杀虫基因测序筛选：利用高通量测序技术分析了90株不同的Bt菌株的序列，进一步通过SOAPdenovo软件拼接、GeneMark基因预测、模式杀虫基因数据库及专利数据库blast比对，最终获得全新杀虫基因21个。总之，本论文建立菌株多样性研究方法，解决了冗余菌株会造成资金的浪费的问题，最终完成了“菌株分离去除冗余基因测序筛选”这一杀虫基因高通量发掘平台的构建，为提升我国在Bt资源发掘中的竞争力提供了重要保障。