西藏生防芽孢杆菌鉴定及其脂肽化合物分析

论文摘要

芽孢杆菌属细菌（Bacillus spp.）是一种革兰氏阳性,产芽孢杆状细菌,好氧或兼性厌氧,广泛分布在自然环境中。其中,芽孢杆菌产生的内生芽孢对高温、干旱、低温和紫外等不良环境有较高的抗逆性。芽孢杆菌作为一类重要的植物根围促生细菌（plant growth promoting rhizobacteria, PGPR）,可以产生各种抑菌物质和诱导植物产生系统获得抗性（induced systemic resistance）防治植物病害。其中,脂肽化合物是芽孢杆菌产生的最主要抑菌化合物,包括伊枯草菌素（Iturin）、表面活性素（Surfactin）和芬枯草菌素（Fengycin）三大类,在植物病害防治过程中发挥着重要的作用。青藏高原为世界上海拔最高的高原,平均海拔4000米以上,由于其独特的极端环境,如低温、缺氧和强辐射等,在该地区可能孕育着特殊的芽孢杆菌。本研究首先对采自西藏地区的35个土样进行芽孢杆菌的分离,共分离得到1388个菌株。以水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）为指示菌,对分离的1375个菌株进行抑菌效果测定,最后得到311株抑菌效果较好的菌株（抑菌圈直径≥5 mm）,然后,对311个抑菌效果好分离菌株进行基因组rep-PCR （repetitive extragenic palindromic PCR）指纹图谱筛选,选取指纹图谱不同的菌株,共得到150个菌株。对经过指纹图谱筛选获得的150个菌株进行生理生化鉴定,然后按照Gordon等人描述的经典分类体系将150个菌株分为7个类群,从每个类群中选取代表性的菌株共31个菌株进行脂肪酸甲酯（fatty acid methyl ester, FAME）鉴定。接着对这31菌株进行分子鉴定,首先进行16S rDNA和gyrB基因序列分析鉴定,然后进行基因组rep-PCR指纹图谱鉴定,包括BOX-PCR和ERIC-PCR指纹图谱分析鉴定。综合表型鉴定和一系列分子鉴定的结果,将分离的有生防潜力的31个芽孢杆菌菌株鉴定为短小芽孢杆菌（B. pumilus）11株,蜡样芽孢杆菌（B. cereus）7株,苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）3株,解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）3株,萎缩芽孢杆菌（B. atrophaeus）3株,B. axarquiensis2株,枯草芽孢杆菌（B. subtilis）1株,地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）1株。从31个菌株中选择有代表性的11个芽孢杆菌菌株进行脂肽化合物MALDI-TOF-MS分析,发现菌株LLCG23能产生surfactin,bacillomycins D和fengycin,菌株NMTD81能产生脂肽类化合物surfactin, iturin和fengycin,菌株YBWC18,LNXM78能产生surfactin和fengycin,菌株NMTD54和GBSW11均能产生bacillomycins L和fengycin两种脂肽类化合物,菌株LSSC22能产生iturin和fengycin两种脂肽类化合物,菌株GBSW2和菌株GBSW19产生了surfactin,菌株DJFZ40只检测到脂肽化合物bacillomycins D,菌株菌株NMSW23在m/z为200-2000的范围内,没有检测到有抑菌活性的脂肽类化合物。并对分离得到的两株对油菜菌核病菌抑菌效果好的菌株YBWC43 （Bacillus amyloliqufaciens）和RJGP18 （Bacillus atrophaeus）进行脂肽类化合物分析发现菌株YBWC43产生BacillomycinD和fengycin,菌株RJGP16产生脂肽化合物surfactin和fengycin,对这两个菌株在油菜离体叶片上进行生防活性检测,菌株YBWC43和RJGP16对油菜菌核病菌的防治效果分别为100%和50.24%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 芽孢杆菌分类及其分类方法进展
• 1 芽孢杆菌属分类进展
• 1.1 《伯杰氏细菌鉴定手册》不同版本芽孢杆菌分类变化
• 1.2 芽孢杆菌属当前分类地位
• 1.3 芽孢杆菌属两个重要种群分类进展
• 2 芽孢杆菌分类方法研究进展
• 2.1 表型分类鉴定法
• 2.2 分子鉴定法
• 第二章 芽孢杆菌的生防应用及其作用机理
• 1. 芽孢杆菌的生防应用
• 2. 芽孢杆菌生防机理研究进展
• 2.1 竞争作用
• 2.2 芽孢杆菌对植物产生诱导抗性
• 2.3 芽孢杆菌拮抗作用
• 下篇 研究内容
• 第一章 西藏生防芽孢杆菌的分离和筛选
• 1 材料和方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂
• 1.4 土样的采集
• 1.5 菌株的分离及纯化
• 1.6 芽孢杆菌的显微鉴定
• 1.7 拮抗芽孢杆菌的筛选
• 1.8 基因组rep-PCR指纹图谱筛选
• 2 结果与分析
• 2.1 芽孢杆菌分离
• 2.2 分离芽孢杆菌抑菌筛选
• 2.3 基因组rep-PCR指纹图谱筛选
• 3 讨论
• 第二章 生防芽孢杆菌的系统发育分析
• 1 材料和方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 生理生化检测
• 1.4 脂肪酸甲酯鉴定
• 1.5 16S rDNA鉴定
• 1.6 gyrB基因鉴定
• 1.7 rep-PCR指纹图谱鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 生理生化检测
• 2.2 脂肪酸甲酯鉴定
• 2.3 16S rDNA鉴定
• 2.4 gyrB基因鉴定
• 2.5 rep-PCR指纹图谱鉴定
• 2.6 多相分类鉴定
• 3 讨论
• 第三章 菌株产生的脂肽化合物分析及两株油菜菌核病菌生防菌离体活性检测
• 第一节 菌株产生的脂肽类化合物MALDI-TOF-MS检测
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第二节 两株油菜菌核病菌生防菌分离及生防活性检测
• 1 材料和方法
• 2. 结果与分析
• 3. 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文