论文摘要
锂盐（lithium）是一种已在临床应用多年的精神稳定性药物,临床调查显示它能降低恶性肿瘤发生的风险。近年来的研究显示锂盐对肿瘤细胞的抑制与它对细胞周期的影响相关,锂能诱导结肠癌细胞（Caco2）,甲状腺癌细胞（thyroid cancer）,白血病细胞（HL-60）,肝癌细胞（SMMC-7721）,食道癌细胞（Eca109）,神经胶质瘤细胞（glimoma）和胚胎瘤细胞（P19）发生G2/M期阻滞,诱导前列腺癌和非小细胞肺癌发生S期阻滞。此外,锂盐也能抑制神经胶质瘤的迁移,促进HL-60和胰腺癌细胞的凋亡,同时有研究表明,锂与TNFα联用能协同增强纤维肉瘤（L929）和横纹肌肉瘤（KYM）细胞的凋亡。锂盐对肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡都有影响,然而具体的生物学机制还未得到满意的解释。本课题主要研究LiCl对黑色素瘤B16F10细胞生长和迁移的影响,以及LiCl与TRAIL联用协同增强A549细胞凋亡的效应。首先,体内外实验确定了LiCl对B16F10细胞生长的抑制作用。流式细胞检测结果显示LiCl诱导B16F10发生了G2/M期阻滞。紧接着我们探讨了LiCl引起B16F10发生G2/M期阻滞的机制。LiCl处理能下调cdc25c的转录水平和蛋白水平、并使cdc2蛋白Tyr15残基磷酸化；同时,LiCl（?）在转录水平上调p53、p21、gadd45和14-3-3几个G2期相关基因的表达,并且上调p53和p21的蛋白表达。以上信号传导的变化最终通过抑制cyclinB1/cdc2复合体的活性使细胞发生G2/M期阻滞。除此之外,LiCl还激活ERK,并抑制JNK。ERK抑制剂U0126能轻微逆转LiCl引起的G2/M期阻滞,JNK抑制剂SP600125能产生与LiCl相似的周期阻滞作用,ERK和JNK的调控至少部分参与了G2/M期阻滞。进一步研究发现,LiCl处理引起了DNA损伤,它上调了DNA损伤修复体系几个关键基因MRE11、 RAD50、Ku70、Ku80以MLH1的mRNA水平,抑制ATM/ATR-Chk1通路能消除LiCl引发的G2/M期阻滞。GSK3P和IMPase是锂盐的两个重要细胞内靶点。尽管LiCl能有效抑制GSK3P活性,但其它的GSK30抑制剂,如SB216763处理或者干扰GSK3P表达均不能模拟LiCl对周期的影响。有报道称锂盐能通过抑制IMPase活性,耗竭细胞内肌醇,但在我们的实验中,给细胞补充肌醇并不能影响LiCl（?）起的周期阻滞效应。此外,虽然LiCl处理激活了p38,并上调了B16F10细胞内的活性氧,但p38抑制剂SB203580及ROS拮抗剂GSH对LiCl的周期阻滞效应没有影响。因此,LiCl对GSK3P和IMPase的抑制、诱导ROS的产生及对p38MAPK的激活均不参与LiCl诱发的B16F10细胞G2/M期阻滞。体外伤口愈合实验和Transwell细胞迁移实验均表明：LiCl能有效抑制B16F10细胞的迁移；体内尾静脉被动转移实验也证实LiCl给药能显著抑制B16F10细胞肺转移。关于LiCl抑制B16F10转移的机制,我们的初步研究结果表明LiCl在转录水平下调了基质金属蛋白酶MMP2的表达,同时上调了黑色素瘤细胞中几个重要的转移抑制基因（nm23, KAI1, Kiss1, Timp3和PTEN）的表达。此外,LiCl还下调了能促进转移的miR-21的表达,同时上调了能抑制转移的miR-31和miR-34a的表达。TRAIL是近年来发现的高效、低毒的新型抗肿瘤药物,然而不少肿瘤细胞对TRAIL具有耐药性,因此联合用药已经成为TRAIL治疗肿瘤的一种新策略。本实验研究发现TRAIL联合LiCl体内外抗肿瘤实验均有显著的协同效应。我们重点探讨了二者联用的协同效应机制,结果发现LiCl可以上调死亡受体DR4和DR5的表达,下调抗凋亡蛋白FLIPs, Bcl-2, Bcl-xl和Survivin的基因转录。TRAIL同LiCl联用后激活Caspase-3, Caspase-8和Caspase-9,使PARP和Bid被剪切,促进细胞凋亡。同时,LiCl还通过抑制JNK通路,激活ATM/ATR-Chk1通路引起A549细胞G2/M期阻滞,进而增强A549细胞对TRAIL的敏感性。虽然LiCl处理A549细胞能激活p38,抑制GSK3P,但ERK, p38, GSK3β和IMPase均不参与TRAIL和LiCl协同刺激诱导A549产生凋亡的过程。综上所述,Li Cl影响肿瘤细胞增殖、迁移和凋亡的机制如下：（1）LiCl通过激活ERK通路和ATM/ATR-Chkl信号通路,抑制JNK通路,调控p53和cdc25c的表达,前者通过上调p21、gadd45和14-3-3的转录,同cdc25c一起抑制cyclinB1/cdc2复合体活性,最终使B16F10细胞阻滞于G2/M期,抑制其生长；（2）LiCl可能通过下调基质金属蛋白酶MMP2,上调转移抑制基因以及对microRNA表达的影响抑制B16F10细胞转移;（3）LiCl通过上调死亡受体DR4和DR5的表达,下调抗凋亡蛋白基因的转录,与TRAIL协同激活Caspase级联反应诱导A549细胞凋亡,同时通过抑制JNK和激活Chk1通路引起细胞G2/M期阻滞增强A549细胞对TRAIL的敏感性。LiCl抗肿瘤机制的阐明将对于临床肿瘤治疗具有重要的理论意义和潜在的应用价值。黏着斑激酶（FAK）是一种定位于黏着斑的非受体型蛋白酪氨酸激酶,在肿瘤细胞生存、增殖、迁移过程中发挥重要调控作用。越来越多证据表明FAK在多种恶性肿瘤中过量表达,其中,FAK水平随着黑色素瘤恶性程度的增高而递增。本课题另外一部分研究即为稳定千扰FAK对黑色素瘤B16F10细胞生长和迁移的影响。体内外实验结果表明,FAK稳定千扰细胞株siFAK生长变慢,且迁移能力与对照相比也明显减弱。初步的机制研究发现稳定干扰FAK能抑制ERK通路激活,下调NCOA3转录表达,并上调CCDC80的nRNA水平另外,过表达C CDC80能抑制肿瘤细胞B16F10和NCI-H446的迁移。以上结果提示FAK可能通过下游ERK信号通路影响NCOA3水平,接着调控CCDC80表达,最终影响B16F10细胞的生长和迁移。