论文摘要
由苏云金芽胞杆菌（Bt）的cry基因编码的杀虫晶体蛋白对多种昆虫、线虫,甚至癌细胞具有特异性毒杀作用、而对人畜无害,已被开发成为使用最成功的一种生物农药。但是,随着Bt杀虫剂和转Bt基因植物的不断推广和使用强度的不断增加,使得杀虫谱相对较窄、靶标生物可能产生潜在抗性、可用的杀虫基因资源较少等问题暴露出来。因此,发掘并克隆更多新型杀虫蛋白基因刻不容缓。本研究围绕新型杀虫基因的克隆展开了如下工作：1.利用高通量发掘平台克隆得到9个新型杀虫蛋白基因。通过我实验室构建的高通量测序新基因发掘平台,筛选出了9个新型杀虫蛋白基因。且它们氨基酸序列与已知蛋白的一致性均小于78%,已完成其出发菌株的确定及克隆。其中杀虫晶体蛋白基因3个；营养期杀虫蛋白基因6个。目前,3个杀虫晶体蛋白基因已得到苏云金芽胞杆菌命名委员会命名,分别是一级新基因cry73Aal和两个二级新基因cry29Bal和cry21Eal。2.杀虫晶体蛋白的表达。本研究表达的杀虫晶体蛋白分两部分：一部分是本实验克隆得到的3个Cry蛋白,其中,cry29Bal和cry21Eal分别在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中进行表达,均能形成近似圆形的晶体,并且产生与预计大小一致的蛋白。有意思的是基因cry73Aal,它与位于其下游的orf2在BMB171中共表达时,能形成菱形晶体并产生与预测一致的两个蛋白。但是分别单独表达时均不能形成晶体蛋白。初步判断orf2是一个新的辅助蛋白基因。另一部分,是本实验室已构建好Bt表达重组菌的8个cry （cry2385, cry67Aal, cry479, cry1719, cry2986, cry21Cal和cry21Dal）基因,通过SDS-PAGE胶检测和镜检观察,发现其都能形成和预测大小相近的晶体蛋白。3.杀虫晶体蛋白的杀虫活性测定。本研究选取上述新蛋白中的10个杀虫晶体蛋白（Cry29Ba1, Cry21Eal, Cry73Aa, Cry2385, Cry67Aal, Cry479, Cry1719, Cry2986,Cry21Caland Cry21Dal）进行活性研究。其中,选择Cry2986、Cry21Eal、 Cry73Aa1、Cry21Dal和Cry21Cal进行了秀丽小杆线虫的生测,发现均能产生生长抑制活性；选取了Cry2986、Cry29Ba1、Cry21Eal和Cry73Aa对鳞翅目的棉铃虫和小菜蛾进行了生物活性测定,均无生长抑制和致死活性。将10个蛋白对致倦库蚊进行了初步的活性测定,发现除了晶体蛋白Cry2385,其他均能对致倦库蚊产生不同程度的致死作用。让人感兴趣的是蛋白Cry2986,它与Cry8Ab的相似性达83%,却没有检测到对鳞翅目的棉铃虫和小菜蛾有毒性,而对秀丽小杆线虫有很强的致死和抑制活性。而目前发现的Cry8类蛋白还未检测出有对小杆目线虫毒性。所以,Cry2986的活性研究拓宽了Cry8类蛋白的杀虫谱。本研究克隆和进行杀虫活性研究的新基因,极大的丰富了杀虫蛋白基因的种类；为新型Bt生物农药的开发和转基因抗虫植物新品种的培育提供新的备选活性基因,为对抗害虫对Bt的抗药性提供了后备基因资源。
论文目录
相关论文文献
标签：苏云金芽胞杆菌论文; 新型杀虫蛋白基因论文; 辅助蛋白论文; 伴胞晶体蛋白论文; 毒性测定论文;