小鼠、兔和牛胚胎干细胞分离培养及其向神经样细胞的分化

论文摘要

胚胎干细胞能在体外维持未分化状态与正常核型、具有无限增殖能力,注入囊胚可形成嵌合体,可分化为来自三个胚层的各种细胞类型。ES细胞被广泛应用于生产转基因动物和克隆动物,构建医学动物模型,研究人类基因功能。利用ES细胞可研究真核细胞的基因表达和调控,寻求细胞分化和细胞修复的机制,研究细胞、组织、器官移植。ES细胞的研究应用已成为生命科学的热点之一。目前哺乳动物ES细胞建系仍存在着品种单一、建系效率低等许多问题,严重影响了ES细胞的研究与应用。本研究比较了不同种属、胚龄、取材、分离、传代方法及消化液、培养液对ES细胞分离培养的效果,对影响ES细胞分离建系的各种因素进行了研究,以求完善小鼠、兔、牛ES细胞的建系方法,提高建系效率。建立了一种不经类胚体阶段直接诱导小鼠EG细胞定向分化为神经细胞的方法,为小鼠EG细胞向神经细胞的体外分化研究提供参考。1.采用分离5日龄小鼠胚胎外胚层进行昆明小鼠ES细胞分离培养,与传统分离ICM的方法相比显著提高了昆明小鼠ES细胞的建系效率（12%&3.3%）;大鼠心肌细胞条件培养液与添加10ng/mL LIF的ES培养液相比,使分离ICM的胚胎传至F1代的比例显著提高（52%&36%）,传至F2代的比例极显著提高（40%&16%）;采用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液连续消化法进行ES细胞分离传代,ICM形成ES细胞克隆的比例提高到50%,ICM获得传至第5代的ES细胞的比例提高至20%;昆明小鼠和BALB/C小鼠胚胎用于ES细胞分离时在胚胎贴壁率、ICM贴壁率、F1和F2代ES细胞出现率上无显著差异;用丝裂霉素C处理MEF 1h适合作为ES细胞培养的饲养层,添加10ng/mL LIF的ES培养液能有效抑制昆明小鼠ES细胞的分化。证实用改进的建系方法可有效地建立昆明小鼠ES细胞系。2.从11.5～12.5日龄昆明小鼠胚胎生殖嵴分离培养PGCs,获得了能连续传9～11代的EG细胞系;用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液多次消化生殖嵴,可有效地保持小鼠PGCs的活力;用差速贴壁法、与胎儿成纤维细胞共培养法分离PGCs,获得了较多的PGCs原代克隆,所得的F1代EG细胞集落百分率显著高于穿刺生殖嵴和取胎儿后1/3部位组织（21%、30%&7%、16%）;2株EG细胞系传代达到11～13代,在第10代时检测AKP呈阳性,第5代时在体外可分化为多种细胞。3.对兔囊胚进行蛋白酶消化和机械切割分离出ICM,在MEF饲养层培养,提高了ICM的贴壁率（60%）,获得了较多的ES细胞集落,而用全胚或离散胚培养不能获得可传代培养的兔类ES细胞集落;应用大鼠心肌细胞条件培养液提高了ICM贴壁率（59%）,能有效抑制兔类ES细胞的分化。证实了经胚胎切割分离兔囊胚ICM在MEF饲养层上用大鼠心肌细胞条件培养液培养,能有效地建立兔类ES细胞系。4.从14～18天兔胚胎生殖嵴及其周围组织分离PGCs的过程中,用酶消化液加机械吹打,能获得有增殖能力的兔PGCs;用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液进行兔类EG细胞分离与传代,所得到的EG细胞集落多,传代数高于0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA浓度消化液组;采用兔PGCs与同源胎儿组织成纤维细胞共培养适合兔类EG细胞分离培养,将兔类EG细胞克隆与成纤维细胞饲养层一起消化进行传代,获得了能连续传代的兔类EG细胞系。5.对5～13周龄牛胎儿生殖嵴分离PGCs时,用percoll液离心和差速贴壁法纯化PGCs,与穿刺生殖嵴法和酶液消化法相比所得的PGCs集落数无差别,但前者后期培养中EG细胞传代数高于后两种方法（13, 7 & 5, 3）;大鼠心肌细胞条件培养液用于牛EG细胞培养时,所得PGCs集落数和EG细胞传代数高于添加LIF的EG细胞培养液组（13&7）;牛胎儿成纤维细胞饲养层可支持牛EG细胞的增殖,并能有效抑制分化;冷冻保存不影响牛PGCs和EG细胞的活力;体外分化试验和AKP染色证实了所分离的牛EG细胞具有多能性。证实了对牛PGCs进行纯化后在牛胎儿成纤维细胞饲养层上用大鼠心肌细胞条件培养液进行培养能有效地建立牛EG细胞系。6.用不经过类胚体阶段的诱导分化方法,对小鼠EG细胞在老化饲养层上长期培养使其达到高密度起动了EG细胞的神经分化,获得了较高比例的神经细胞样集落（62.9%（78/124））,用RA进一步进行诱导可产生TH+阳性神经元细胞。经检测EG细胞源神经细胞样集落外层细胞以及从集落中迁出的细长细胞均表达神经前体细胞标志nestin,应用高浓度的RA对神经细胞样克隆诱导,可获得2.3±0.2%的TH+神经元细胞。应用不同浓度的RA对离散后的神经细胞样集落进行诱导,TH+阳性细胞的比例在一定范围内随着RA浓度升高和分化时间的延长而上升;对EG细胞源神经前体细胞进行冷冻保存,解冻后细胞存活率83.2%,继续培养仍具有增殖和分化能力,冷冻不影响EG源神经前体细胞的活力。在不更换饲养层连续增殖达到高密度的情况下培养小鼠EG细胞,建立了一种简单而有效的小鼠EG细胞体外分化为神经细胞的培养体系,能有效产生TH+神经细胞。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 哺乳动物胚胎干细胞和胚胎生殖细胞
• 1.1 ES 细胞研究的概况
• 1.1.1 ES 细胞研究的历史起源：胚胎瘤细胞（Embryonic carcinoma cells or embryonic carcinoma stem cells, EC cells）
• 1.1.2 哺乳动物ES 细胞研究的历史与现状
• 1.1.2.1 小鼠
• 1.1.2.2 兔
• 1.1.2.3 猪
• 1.1.2.4 牛
• 1.1.2.5 人类
• 1.2 PGCS 来源的EG/ES 细胞研究概况
• 1.2.1 小鼠
• 1.2.2 兔
• 1.2.3 牛
• 1.2.4 猪
• 1.2.5 人
• 1.3 胚胎干细胞的生物学特性
• 1.3.1 胚胎干细胞的生物学特性
• 1.3.2 维持胚胎干细胞生物学特性的分子机制
• 1.3.2.1 LIF 及其相应信号通路对ES 细胞多能性的维持
• 1.3.2.2 BMP 信号通路
• 1.3.2.3 Wnt 信号转导途径
• 1.3.2.4 Oct 与ES 细胞多能性
• 1.3.2.5 Nanog 与ES 细胞多能性维持
• 1.4 ES 细胞分离建系的方法
• 1.4.1 ES 细胞分离材料的获取及处理方法
• 1.4.1.1 早期胚胎的处理方法
• 1.4.1.2 PGCs 的分离
• 1.4.2 ES 细胞的培养
• 1.4.2.1 ES 细胞培养的分化抑制物
• 1.4.2.2 常用基础培养基
• 1.4.2.3 常用添加物
• 1.4.2.4 ES 细胞的克隆和传代
• 1.4.2.5 ES 细胞冷冻和解冻
• 1.4.2.6 ES 细胞的鉴定方法
• 1.5 影响ES 细胞分离建系的因素
• 1.5.1 遗传背景对ES 细胞分离培养的影响
• 1.5.2 胚龄与分离培养方式对ES 细胞建系的影响
• 1.5.2.1 胚龄
• 1.5.2.2 分离培养方式
• 1.5.3 饲养层
• 1.5.4 培养基
• 1.5.5 条件培养液、细胞因子和生长因子
• 1.5.5.1 条件培养液
• 1.5.5.2 细胞因子和生长因子
• 1.6 ES 细胞的体外分化研究现状
• 1.6.1 胚胎干细胞诱导分化的一般方法
• 1.6.1.1 细胞因子诱导法
• 1.6.1.2 选择性标记基因筛选目的细胞法
• 1.6.1.3 特异性转录因子异位表达法
• 1.6.2 ES 细胞分化为造血细胞
• 1.6.3 ES 细胞分化为神经细胞
• 1.6.4 ES 细胞体外分化为心肌细胞
• 1.6.5 由ES 细胞分化为胰岛细胞
• 1.7 ES 细胞的应用前景
• 1.7.1 生产克隆动物
• 1.7.2 生产转基因动物
• 1.7.3 研究发育和细胞分化
• 1.7.4 在细胞和组织修复中的作用
• 1.7.5 治疗性克隆
• 研究部分
• 前言
• 第二章 昆明小鼠胚胎干细胞分离、培养
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 动物来源
• 2.1.1.2 主要试剂
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）饲养层的制备
• 2.1.2.2 大鼠心肌细胞条件培养液制备
• 2.1.2.3 囊胚的获取与培养
• 2.1.2.4 内细胞团的分离
• 2.1.2.5 胚胎外胚层的分离与培养
• 2.1.2.6 ES 细胞集落分离传代
• 2.1.2.7 ES 细胞的鉴定
• 2.1.2.8 ES 细胞和胎儿成纤维细胞的冷冻与解冻
• 2.1.3 实验设计与统计方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 小鼠胎儿成纤维细胞的培养与饲养层的制备
• 2.2.2 大鼠心肌细胞的分离培养
• 2.2.3 品系对小鼠ES 细胞培养、克隆、分离、传代的影响
• 2.2.4 不同日龄胚胎和不同取材方法对ES 细胞分离培养的影响
• 2.2.5 大鼠心肌细胞条件培养液对小鼠ES 细胞分离、培养、传代的影响
• 2.2.6 不同消化液及消化方法对ES 细胞分离、克隆、传代的影响
• 2.2.7 ES 细胞形态与生长方式观察
• 2.2.8 碱性磷酸酶活性检查（AKP 染色）
• 2.2.9 体外分化能力
• 2.2.10 核型分析
• 2.2.11 ES 细胞和胎儿成纤维细胞的冷冻与解冻
• 2.3 讨论
• 2.3.1 品系和胚龄对ES 细胞分离培养的影响
• 2.3.2 分离培养方式对ES 细胞培养建系的影响
• 2.3.3 条件培养液、饲养层和细胞因子对ES 细胞分离培养的影响
• 2.4 小结
• 第三章 自PGCS 分离、克隆昆明小鼠EG 细胞的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）饲养层的制备
• 3.1.2.2 PGCs 分离
• 3.1.2.3 细胞传代
• 3.1.2.4 碱性磷酸酶（AKP）染色
• 3.1.2.5 体外分化能力鉴定
• 3.1.2.6 EG 细胞冷冻
• 3.1.3 实验设计与统计方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 小鼠PGCs 生长情况
• 3.2.2 不同PGCs 分离方式对小鼠EG 细胞分离、传代的效果
• 3.2.3 不同传代方式对EG 细胞分离、克隆的影响
• 3.2.4 不同日龄的胚胎分离培养EG 细胞的效果
• 3.2.5 碱性磷酸酶活性检查（AKP 染色）
• 3.2.6 体外分化能力
• 3.3 讨论
• 3.3.1 胚胎日龄对EG 细胞分离培养的影响
• 3.3.2 PGCs 分离方式对EG 细胞培养的影响
• 3.3.3 消化液和传代方式对EG 细胞培养的影响
• 3.3.4 细胞因子和饲养层对EG 细胞分离培养的影响
• 3.4 小结
• 第四章 兔胚胎干细胞分离培养
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.1.1 实验动物
• 4.1.1.2 主要试剂
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 胚胎获取及培养
• 4.1.2.2 饲养层制备
• 4.1.2.3 胚胎处理
• 4.1.2.4 内细胞团集落的分离
• 4.1.2.5 ES 细胞集落分离、传代
• 4.1.2.6 ES 培养液
• 4.1.2.7 大鼠心肌细胞条件培养液的制备
• 4.1.2.8 ES 细胞的鉴定
• 4.1.2.9 ES 细胞的冷冻
• 4.1.3 实验设计与统计方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 兔胚胎的形态特征
• 4.2.2 不同饲养层对兔ES 细胞分离的效果
• 4.2.3 不同胚胎处理方式对兔ES 细胞的分离效果
• 4.2.4 大鼠心肌细胞条件培养液对兔ES 细胞分离、传代的影响
• 4.2.5 兔类ES 细胞的鉴定
• 4.3 讨论
• 4.3.1 胚胎日龄对ES 细胞分离的影响
• 4.3.2 饲养层对ES 细胞分离的影响
• 4.3.3 胚胎处理方式对ES 细胞分离的影响
• 4.3.4 条件培养液和细胞因子对ES 细胞培养的影响
• 4.4 小结
• 第五章 自PGCS 分离克隆兔EG 细胞
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 实验动物
• 5.1.1.2 试剂
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 兔胎儿的生殖嵴的获取
• 5.1.2.2 胎儿生殖嵴的处理
• 5.1.2.3 EG 细胞的传代培养
• 5.1.2.4 碱性磷酸酶染色
• 5.1.2.5 体外分化试验
• 5.2 结果
• 5.2.1 体外培养的兔PGCs 的生长情况
• 5.2.2 兔PGCs 传代后的生长
• 5.2.3 不同浓度的消化液对兔PGCs 分离培养的效果
• 5.2.4 AKP 染色结果
• 5.2.5 体外分化结果
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 第六章 牛胚胎生殖细胞的分离与培养
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.1.1 牛胎儿
• 6.1.1.2 试剂
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 牛和小鼠胎儿成纤维细胞的分离培养与饲养层的制备
• 6.1.2.2 大鼠心肌细胞条件培养液的制备
• 6.1.2.3 从牛胎儿生殖嵴分离与纯化PGCs
• 6.1.2.4 EG 细胞培养液
• 6.1.2.5 细胞传代
• 6.1.2.6 牛EG 细胞的鉴定
• 6.1.2.7 牛胎儿成纤维细胞和EG 细胞的冷冻与解冻
• 6.1.3 数据统计方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 牛胎儿成纤维细胞的生长情况
• 6.2.2 牛PGCs 和EG 细胞的形态与生长方式
• 6.2.3 不同饲养层对牛EG 细胞培养的效果
• 6.2.4 不同的生殖嵴处理方式对牛EG 细胞分离培养的效果
• 6.2.5 大鼠心肌细胞条件培养液用于牛EG 细胞培养的效果
• 6.2.6 EG 细胞鉴定
• 6.3 讨论
• 6.3.1 胚龄对PGCs 分离培养的影响
• 6.3.2 分离培养方式对PGCs 的影响
• 6.3.3 条件培养液、细胞因子和饲养层对EG 细胞分离培养的影响
• 6.4 小结
• 第七章 小鼠EG 细胞体外分化为神经细胞的研究
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 方法
• 7.1.2.1 小鼠EG 细胞的分离与培养
• 7.1.2.2 EG 细胞的体外神经分化与检测
• 7.1.2.3 RA 诱导EG 细胞分化
• 7.1.2.4 EG 细胞来源的神经前体细胞的传代培养与冷冻保存
• 7.1.3 数据统计方法
• 7.2 结果
• 7.2.1 小鼠EG 多能干细胞在老化饲养层上的分化
• 7.2.2 不同浓度RA 对EG 细胞的诱导效果
• 7.2.3 EG 细胞来源的神经前体细胞的冷冻保存
• 7.3 讨论
• 7.3.1 EG 细胞的分化潜能
• 7.3.2 不同诱导分化方法对ES 细胞神经分化的影响
• 7.3.3 EG 细胞分化的时序性
• 7.4 小结
• 结论
• 创新点
• 进一步研究的课题
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介