异丙酚对大鼠内毒素血症外周血单核细胞蛋白质表达的影响

论文摘要

静脉全麻药异丙酚（propofol）被广泛应用于临床麻醉和ICU镇静。近年来,异丙酚抑制炎症反应的功能,越来越受到人们的重视,这方面的研究和报道也日趋增多。但有关异丙酚抗炎的具体信号转导机制,并不清楚,无法形成完整的理论,从而局限和阻碍了异丙酚抗炎的具体临床应用。在全身炎症反应中,单核细胞是最重要的效应细胞。因此从血液单核细胞蛋白质谱入手,作为研究异丙酚抗炎作用机制的重要切入点。既往已经有很多文献报道,在炎症状况下,异丙酚能够抑制炎症介质IL-1β,IL-6,TNF-a的释放,而对于异丙酚抑制这些炎症因子释放的具体作用机制却知之甚少。本研究从炎症反应中心环节——血管反应入手,建立内毒素血症大鼠模型,对大鼠血液中单核细胞蛋白进行双向电泳分析,寻找与炎性反应相关的,受异丙酚调控的蛋白。在建立大鼠内毒素血症的基础上,提取外周血单核细胞,并进行裂解,双向电泳,质谱鉴定蛋白质,并得到表达有差异的蛋白。我们选择与炎症密切相关的蛋白质膜联蛋白A1（Annexin A1）,通过重建模型,我们通过western blot方法对膜联蛋白A1进行进一步的验证,结果显示与双向电泳结果一致,进一步验证了膜联蛋白A1在异丙酚抗炎过程中起了重要的作用。同时我们对血清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α并进行检测,发现Annexin A1可以显著的抑制三者的表达,差异具有统计学意义。膜联蛋白A1在异丙酚抗炎信号转导机制中起了重要的作用,有研究表明：AnnexinA1强烈抑制细胞IL-6的的表达,此种效应则是通过P38MAPK激活影响mRNAd稳定。P38MAPK是丝氨酸／苏氨酸相互转化的重要一个过程,是一种促进细胞分裂的蛋白激酶。P38通路的激活在前炎性因子（比如IL-1β,TNF-α和IL-6）的产生中起了重要作用,对某些酶的诱导作用,比如环氧化酶2 （COX-2）,COX-2可以控制病理条件下结缔组织的塑形；作为一种氧化作用的调节因子,可以调节iN0的表达；诱导血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）、其他的粘附蛋白以及其他的炎性相关的分子。在内毒素休克的大鼠模型中,异丙酚对p38MAPK的激活的抑制作用可能是异丙酚减少中性粒细胞浸润的原因；可以减少内毒素血症大鼠的死亡率并减少他们的细胞因子反应。材料和方法：1.验动物准备与分组：18只雄性SD大鼠,体重180-220 g,均禁食过夜,用乌拉坦（1.0g／kg）肌肉注射麻醉后,行右侧股静脉插管建立静脉输液通道。将18只SD大鼠随机分为内毒素组（L组）、内毒素+异丙酚组（L+P组）和对照组（C组）,每组6只.2.动物模型制作及药物输注：L组：通过股静脉注入内毒素10mg/kg,然后以10 mg.kg-1h-1的速度持续输注10%脂肪乳,持续输注6h.C组：通过股静脉注入与内毒素等容量生理盐水后,然后以10 mg.kg-1h-1的速度持续输注10%脂肪乳,持续输注6h.L+P组：通过股静脉注入内毒素10mg/kg,然后以10 mg.kg-1h-1的速度持续输注异丙酚,持续输注6h.3.标本采集：输注药物6h后,分离大鼠右侧颈动脉,取血3-5ml,肝素钠抗凝管抗凝4.标本处理：（1）将3ml抗凝过的大鼠血加入到盛有3ml单核细胞分离液的分离管中.（2）室温下400g离心30min,血液分层,吸取白膜层（单核细胞层）,加入到另一干净离心管中,加入10mlDPBS,轻轻吹打混匀,250g离心10min（3）将离心管中上层液体弃之,加入5mlDPBS,吹打混匀,250g离心10min（4）重复步骤上一步（5）按照细胞体积4倍加入裂解液,4℃冰箱静置30min,（6）4℃离心机、12000rpm,离心15min,取上清液,-80℃冻存.5.双向电泳5.1定量将各组内的裂解细胞混合在一起,采用bradford法进行蛋白定量,参照试剂盒的说明进行操作。各组蛋白质浓度在10-15ug／ul,各组间的浓度较接近.5.2第一向等电聚集采用Amersham IPGghor公司的第一向等电聚焦系统及Ettan Daltsix垂直电泳系统,参照仪器说明书进行操作。采用24cm,ph值3-10的胶条,上样量为150ug；泡涨盘泡涨12小时.转入第一向等电聚焦系统,电泳条件设置是：S1（200v, 1hr,200vhs, step）,S2 （500v, 1hr,500vhs, step）,S3（1000v, 1hr, 1000vhs, step）,S4（5000v, 1hr,5000vhs, step）,S5（8000v,0.5hr,4000vhs, Grad）,S6（8000v, 6.5hr,60000vhs, step）,S7 （500v,5hr,500vhs, step）5.3平衡：两步平衡法进行平衡,各15min5.4 SDS-PAGE电泳电泳条件设置为：s1（5w per gel,45min）,s2（20w per gel,6h,当溴酚蓝迁移到胶的底部即可结束电泳）；5.5染色双向结束后,采用Amersham公司Coomassie Brilliant Blue R250染料,按建议的流程进行染色。6、扫描分析考染后的双向电泳凝胶,采用Umax PowerLook 1100投射扫描仪进行扫描,以TIF格式保存图像。采用Bio-Rad二维图谱分析软件PDQuest 8.0进行图像分析,包括背景削减,去除条纹、斑点检测,匹配等分析。软件自动匹配与人工匹配相结合,设定表达量相差2倍以上为差异表达范围,软件自动进行分析,给出差异表达蛋白质点的数据信息。7、质谱鉴定、蛋白质检测和数据分析通过4800 MALDI TOF/TOF Analyzer （Applied Biosystems,USA）进行蛋白质样品的质谱鉴定。用肽质量指纹图谱（Peptide Mass Fingerprint,PMF）和肽序列标签通过MASCOT搜索引擎（http://www.matrixscience.com/.确MatrixSicence Ltd.,London, UK）并对照SwissProt蛋白质数据库对蛋白质进行检测和数据分析。肽段的质量误差在0.01-0.1%范围内。匹配肽段超过4个,MASCOT得分大于64分的蛋白认为有统计学意义8、膜联蛋白A1的验证8.1动物分组和药物输注将新的24只雄性SD大鼠,体重180-220 g,随机分为四组内毒素组（L组）对照组（C组）内毒素组+异丙酚（L+P组）异丙酚组（P组）模型制作及药物输注L组：通过股静脉注入内毒素10 mg/kg,然后以10 mg.kg-1h-1的速度持续输注10%脂肪乳,持续输注6hC组：通过股静脉注入与内毒素等容量生理盐水后,然后以10 mg.kg-1h-1的速度持续输注10%脂肪乳,持续输注6hL+P组：通过股静脉注入内毒素10 mg/kg,然后以10 mg.kg-1h-1的速度持续输注异丙酚,持续输注6hP组：通过股静脉注入与内毒素等容量生理盐水后,然后以10mg.kg-1h-1的速度持续输注异丙酚,持续输注6h8.2样品采集及细胞蛋白裂解输注6h为采血点,每只大鼠取血约6ml,其中3ml用于分离单核细胞,3ml用于分离血清,将分离的单核细胞裂解,裂解后的蛋白-80℃冻存。8.3 western blot检测对质谱分析得到的差异蛋白点进行Western blot验证。从各组提取500 u g总蛋白后用12% SDS-PAGE胶分离,并转至PVDF膜。随后,用含5%脱脂奶三粉的TBST溶液封闭PVDF膜1 h。封闭结束后,在摇床上与一抗anti-Annexin A1 rabbit polyclonal antibody （1:1000; Abcam）4℃孵育过夜。孵育结束后,已经结合一抗的PVDF膜用TBST溶液漂洗3次,接着与辣根过氧化酶偶联的二抗horseradish peroxides-conjugated anti-rabbit immunoglobulin G（1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers MA）溶液孵育1 h,实验采用增强化学发光法。Western blot结束后的图像由Image station 2000R系统（美国Kodak公司）成像,并用生产商提供的软件进行分析。8.4 ELISA法检测Annexin A1表达的增高能够抑制血清中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-a的释放的释放,我们采用ELISA试剂盒检测了各组大鼠血清中上述炎症因子的含量,8.5磷酸化P38MAPK的检测使用抗磷酸化P38MAPK （Thr180/Tyr182） （3D7）兔多克隆抗体（1：1000；Cell Signaling Technology）和辣根过氧化物酶偶联抗兔免疫球蛋白G（1:2000;Cell Signaling Technology, Danvers MA）检测P38MAPK。9、数据分析采用SPSS13.0统计软件包,计量资料以均数±标准差（x±s）表示,组间IL-1β、IL-6、TNF-α以及Westernblot胶的灰度值的比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义结果：1、裂解后的细胞,各组内混合,采用bradford法进行蛋白定量,参照试剂盒的说明进行操作。各组蛋白质浓度在10-15ug/ul,各组间的浓度较接近,蛋白提取方法重复性较好.2、通过双向电泳及质谱鉴定,我们得到18个表达有差异的蛋白,并成功鉴定出15个,在这些蛋白中：a.UMP-CMP kinase和Myosin-9在对照组中表达最低b.Cofilin-1,ATP synthase subunit alpha, mitochondrial precursor和Hemoglobin subunit alpha在LPS组中表达最低；c.对照组,LPS组和LPS+异丙酚组中Destrin和Glutathione peroxidase 1的表达呈逐渐增高的趋势；d.Protein S100-A8,L-lactate dehydrogenase A chain,Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B precursor, Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, mitochondrial precursoe和Annexin A1的表达仅在LPS+异丙酚组显著增高；e.S-phage kinase-associated protein 1仅在LPS组中出现；f.Ubiquitin仅在对照组中表达最强。3、Annexin A1是IL-1p,IL-6和TNF-α的负性调节因子,对P38 MAPK信号转导通路的激活起抑制作用,我们的双向电泳和western blot结果显示：在内毒素血症的大鼠中,异丙酚可以使血液中单核细胞中Annexin Al表达增加，因此我们进一步研究了异丙酚对内毒素血症大鼠P38激活的影响,未经LPS处理过的脂肪乳组和异丙酚组,P38的磷酸化处在一个较低的基础水平,LPS可以明显的增加单核细胞中P38的磷酸化水平,这种影响可以被异丙酚部分的抑制4、Western blot检测,结果显示Annexin A1在L组表达量最低,而在C组和P组表达量相当,而在L+P组表达量显著增加；ELISA法检测了各组大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-a的含量,结果显示：与LPS组相比,LPS+异丙酚组大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量显著较低,差异具有统计学意义。结论：1、利用蛋白质组学的方法,首次发现了异丙酚能够显著增加内毒素血症大鼠单核细胞中炎症调蛋白Annexin A1的表达：2在内毒素血症大鼠中,异丙酚可能通过炎性蛋白Annexin A1表达的上调,抑制p38MAPK磷酸化,从而抑制炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的产生

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 材料和方法
• 1、主要试剂和药品
• 2、主要仪器设备
• 3、实验动物来源
• 4、实验动物准备与分组
• 5、动物模型制作及药物输注
• 6、标本采集
• 7、标本处理
• 8、双向电泳
• 9、扫描分析
• 10、质谱鉴定、蛋白质检测和数据分析
• 11、膜联蛋白A1的验证
• 12、统计学分析
• 第三章 实验结果
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 成果
• 致谢
• 统计学证明