嗜热菌几丁质结合域及其在酶固定化中应用的研究

论文摘要

生物亲和纯化固定化技术可以使目的蛋白的纯化与固定化一步完成,具有固定条件温和、固定化率高等优点,利用该技术开发固定化酶的研究受到越来越多的关注。几丁质结合域（ChBD）因其分子量小、对目的蛋白结构影响小、与载体亲和力高且其载体几丁质廉价无毒而有很大的应用价值。本研究通过基因合成的方法获得了来自于嗜热解糖厌氧菌（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571）的几丁质结合域Tt-ChBD,它与嗜温菌Bacillus circulans WL 12几丁质结合域（Bc-ChBD）有72%的氨基酸同源性。将Tt-ChBD与双活性酶XAR融合获得融合酶)CAR-L-Tt-ChBD（XC）,按照相同方法获得融合酶XAR-L-Bc-ChBD （XBC）.实验结果显示Tt-ChBD对胶状、溶胀几丁质具有很强的吸附专一性。当给酶量在1-6 nmol范围时,Tt-ChBD与胶状几丁质的结合率在70%以上,与Bc-ChBD相似,当给酶量为12 nmol时,Tt-ChBD结合量、结合率分别为6.6 nmol和55%,略高于Bc-ChBD。在较高温度下（75℃） Tt-ChBD比Bc-ChBD具有较好的几丁质结合能力,结合率分别为74%、53.8%。Tt-ChBD和Bc-ChBD的最适结合pH均为4.0,在pH 3.0、9.0和10.0时,Tt-ChBD比Bc-ChBD的结合率较高。在0～3 mol/L NaCl浓度范围内,Tt-ChBD与胶状几丁质的结合率高于Bc-ChBD,高离子浓度有利于ChBD与几丁质的结合。用固定化融合酶XAR-L-Tt-ChBD分批水解低聚木糖,前5次的木糖产率达80%以上,连续催化30批次时产率为60%。利用基因重组技术将Tt-ChBD分别与Tm-BglA、Te-BglA融合,获得融合酶Tm-BglA-Tt-ChBD和Te-BglA-Tt-ChBD。使用固定化Tm-BglA-Tt-ChBD水解5%乳糖溶液,连续操作20次后乳糖转化率均大于90%。使用固定化Te-BglA-Tt-ChBD作用于30%乳糖制备乳寡糖（GOS）,乳寡糖的产量约占总糖的30%,成分包括大量的三糖和少量的四糖,连续操作10次后乳寡糖的产量几乎不变。经SDS-PAGE检测,以上三种固定化融合酶的纯度都较高。上述结果表明Tt-ChBD与几丁质载体结合牢固,稳定性好,有利于在生产中应用。通过改变Tt-ChBD的融合位置构建并表达两种融合酶Tt-ChBD-L-XAR-L-XynA（CXX）和XAR-L-XynA-L-Tt-ChBD （XXC）。在相同表达条件下,XXC的蛋白表达量高于CXX。在给酶量0.3～1.8 U范围内CXX与胶状几丁质的结合率高于XXC。游离、固定化融合酶CXX和XXC与XAR-L-XynA有着相似的最适温度和pH。其中固定化CXX和XXC在85℃时热稳定性比游离酶高,在pH 4.2-8.2范围内稳定性也高于游离酶。用固定化XXC连续水解木聚糖,第1批次木糖产量为2.23 mg/mL,连续催化19批次后木糖产率仍有50%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 缩写表
• 第1章 前言
• 1.1 几丁质与几丁质酶
• 1.1.1 几丁质的结构与性质
• 1.1.2 几丁质酶的分类
• 1.1.3 几丁质酶的结构
• 1.2 固定化酶
• 1.2.1 固定化酶概述
• 1.2.2 固定化酶的制备方法
• 1.3 几种糖苷酶的介绍
• 1.3.1 木聚糖酶
• 1.3.2 木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶
• 1.3.3 葡萄糖苷酶
• 1.4 研究背景与研究内容
• 1.4.1 几丁质结合域的研究背景
• 1.4.2 几丁质结合域在固定化酶上的应用
• 1.4.3 本实验组研究背景
• 1.4.4 研究内容
• 第2章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂及其来源
• 2.1.4 主要仪器设备及其来源
• 2.2 方法
• 2.2.1 感受态细胞的制备
• 2.2.2 电转化
• 2.2.3 基因操作
• 2.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.5 蛋白质浓度的测定
• 2.2.6 Ni-NTA Agarose亲和层析纯化
• 2.2.7 DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析
• 2.2.8 木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶活性测定
• 2.2.9 薄层层析（TLC）
• 2.2.10 DNS法检测还原糖
• 2.2.11 胶状几丁质的制备
• 2.2.12 Tt-ChBD性质的初步研究
• 2.2.13 Tt-ChBD在酶固定化中的应用
• 2.2.14 带Tt-ChBD的融合酶降解木聚糖实验
• 第3章 结果
• 3.1 Tt-ChBD性质的初步研究
• 3.1.1 重组质粒pHsh-Tt（Bc）-ChBD的构建与验证
• 3.1.2 重组质粒pHsh-xar-L-Tt（Bc）-ChBD的构建
• 3.1.3 重组酶XC/XBC的纯化
• 3.1.4 不同载体介质的吸附率比较
• 3.1.5 游离酶与固定化酶XC热稳定性
• 3.1.6 XC与XBC结合性质比较
• 3.2 Tt-ChBD在酶固定化中的应用
• 3.2.1 固定化酶XC制备木糖的研究
• 3.2.2 固定化酶Tm-BglA-Tt-ChBD水解乳糖的研究
• 3.2.3 固定化酶Te-BglA-Tt-ChBD连续制备乳寡糖的研究
• 3.3 带Tt-ChBD的融合酶降解木聚糖实验
• 3.3.1 带Tt-ChBD融合酶重组质粒的构建
• 3.3.2 融合酶的酶学性质分析
• 3.3.3 固定化融合酶连续水解木聚糖实验
• 第4章 讨论
• 4.1 Tt-ChBD性质的初步研究
• 4.2 Tt-ChBD在酶固定化中的应用
• 4.3 带Tt-ChBD的融合酶降解木聚糖实验
• 主要结论
• 创新点
• 参考文献
• 致谢