成骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外骨形成的实验研究

论文摘要

目的:为骨组织工程种子细胞的来源选择提供新的思路。1.探讨在不使用细胞因子或化学药物的情况下,成骨细胞提供的成骨微环境能否在体外诱导骨髓基质细胞（Bone Marrow Stromal Cells BMSCs）向成骨细胞分化并形成成熟的骨组织。2.成骨细胞在混合细胞中的比例至少达多少时已有较为肯定的成骨效果。方法:1.改进酶消化法结合反复贴壁法培养1d龄SD乳鼠的成骨细胞。2.形态学观察结合ALP染色、钙结节染色、I型胶原染色等检测手段对成骨细胞进行鉴定。3.运用全骨髓贴壁法分离培养4 w龄SD大鼠的BMSCs。4.BMSCs的鉴定:形态学观察;流式细胞法检测表面抗原、细胞周期和细胞活力。5.将成骨细胞和BMSCs以1∶9、2∶8、3∶7、1∶0的不同比例进行混合培养,通过测定3、6、9d培养液上清中的ALP的含量,研究成骨细胞促BMSCs成骨分化的最佳比例浓度。6.相分离法结合冷冻干燥法制作涂敷I型胶原的壳聚糖支架材料,并进行扫描电镜的观察。7.将第三代的成骨细胞、BMSCs种植到壳聚糖支架材料上,研究两种细胞与材料的相容性并比较其增殖能力。8.以最佳比例混匀成骨细胞与BMSCs,以5.0×107/ml的终浓度接种于I型胶原修饰后的壳聚糖支架材料（直径9mm,高3mm）作为共培养组,相同终浓度的单纯成骨细胞和单纯BMSCs分别接种于相同支架作为阳性对照及阴性对照,1.0×107/ml（相当于共培养组中成骨细胞数）的单纯成骨细胞接种作为低浓度成骨细胞对照。每组各接种6例标本,每例接种细胞悬液200μl。全部标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生骨进行评价。结果:1..改进酶消化法结合反复贴壁法成功培养出成骨细胞。形态学观察具有成骨细胞的典型形态学特征;ALP、钙结节、I型胶原染色为阳性。2.贴壁生长法成功培养出BMSCs。形态学观察具有BMSCs的典型形态学特征;表达CD29、CD44,不表达CD34和CD45;细胞活力为81.33%,G0-G1细胞占86.14%。3.成骨细胞和BMSCs以3∶7的比例进行混合培养时,成骨细胞促BMSCs成骨分化的效果最佳。4.相分离法结合冷冻干燥法制作的壳聚糖支架材料,具有良好的三维立体结构。孔隙率为90%,孔径大小为100μm,I型胶原涂敷均匀,是理想的支架材料之一。5.成骨细胞、BMSCs均与材料支架黏附良好。两者在支架上的增殖能力无明显差别。6.3∶7比例的共培养组及阳性对照组（成骨细胞组）体外培养8周后均形成了较成熟的骨组织,并基本保持了复合物初始的大小和形状,两组新生组织外观及组织学特征基本相同,免疫组织化学也显示两组均表骨特异性细胞外基质I型胶原。定量测定结果表明,共培养组的ALP、I型胶原含量均接近阳性对照组。阴性对照组（单纯BMSCs组）在体外培养过程中逐渐皱缩变形,未发现骨样组织形成。低浓度成骨细胞组在体外培养过程中也出现了明显的皱缩变形,组织学显示只在局部形成了不连续的骨组织结论:1.在不使用细胞因子或化学药物的情况下,成骨细胞提供的成骨微环境能够在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化并形成成熟的骨组织。2.混合细胞中成骨细胞与BMSCs的比例为3∶7时成骨效果最佳。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1.骨组织工程种子细胞的研究概况
• 2.BMSCs向成骨细胞定向分化的研究现状
• 3.本课题研究思路的提出
• 4.实验的研究内容
• 实验一 成骨细、BMSCs的体外培养和鉴定
• 1.研究目的
• 2.实验材料
• 3.实验方法
• 4.实验结果
• 5.讨论
• 6.结论
• 实验二 SD大鼠成骨细胞对其MSCS骨向分化的干预研究
• 1.研究目的
• 2.实验材料
• 3.实验方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 6.结论
• 实验三 成骨细胞、BMSCs与I型胶原修饰的壳聚糖生物支架材料相容性的研究
• 1.研究目的
• 2.实验材料
• 3.实验方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 6.结论
• 实验四 成骨细胞与BMSCs共培养体外骨形成的实验研究
• 1.实验目的
• 2.实验材料
• 3.实验方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 6.结论
• 参考文献
• 主要缩略语中英文对照
• 附录
• 在读期间发表的论文
• 在读期间参加的主要科研项
• 在读期间参加的主要学术会议
• 实验动物合格证
• 致谢