鸡胚中RNAi方法的建立及其在鸡DMRT1基因功能研究中的初步应用

论文摘要

本研究围绕种蛋的开窗、干扰载体转染鸡胚以及干扰效果的检测三个方面在鸡胚模型中成功建立了RNAi技术,并使用该技术对鸡的性别决定候选基因之一DMRT1基因功能进行了初步研究。研究结果如下:1.利用5日龄鸡胚的成活率为指标,以正常孵化组（组1）为对照,比较机械开窗（组2）、盐酸腐蚀不去壳膜（组3）和去壳膜（组4）三种处理对鸡胚的影响,结果表明机械开窗组鸡胚的成活率最低,仅14.29%;盐酸腐蚀开窗后去壳膜组孵化率最高,达77.27%:机械开窗组与其他三组比较,所得的5日龄成活率较其他三组差,差异极显著(|U|＞U0.01);同时盐酸腐蚀开窗的方法与正常组成活率相比差异不显著;盐酸腐蚀开窗后去壳膜和不去壳膜组之间的差异不显著(|U|＜U0.05)。结果表明,盐酸腐蚀开窗的方法能有效地降低开窗处理对种蛋的影响,是一种安全、有效的方法开窗方法。2.通过比较电穿孔转染、脂质体介导、直接注射三种将空载干扰质粒转染鸡胚的方法,结果表明电穿孔转染法所得的成活率比其他两种方法的成活率低,差异极显著(|U|＞U0.01),其他两种方法所得的成活率之间的差异不显著(|U|＜U0.05);电穿孔法所获得的转染率明显高于其他两种方法(|U|＞U0.05),其他两种方法间的转染率差异不显著(|U|＜U0.05)。同时,我们发现通过卵黄囊血管注射法,干扰载体在鸡胚的头部、体节中部及尾部均有表达、我们推测载体可能会通过血液循环到达鸡胚其他组织器官;电穿孔方法处理时,载体的表达部位仅局限于两根电极所在的部位。本研究综合各种情况,采用电穿孔法将干扰载体转染鸡胚,但卵黄囊血管注射的方法将干扰载体转染鸡胚可以作为一个很好的转染方法用于以后的试验。3.将空载干扰质粒转染鸡胚后,在不同时间段取出检测绿色荧光蛋白的表达情况。本试验分别在转染后6h-120h（每次间隔6h）在活体成像系统中检测绿色荧光蛋白的表达情况。最终确定转染12h后绿色荧光蛋白就开始表达,至转染后120h时还有荧光蛋白表达,且转染48h后,质粒的表达率最高。4.以DMRT1基因为目标,验证上面建立的鸡胚中RNA干扰方法的效果。首先构建了针对DMRT1基因的RNA干扰载体,并采用上述的开窗方法及转染方法将构建的干扰载体转染孵化72h（3日龄）的鸡胚中,收集转染后48h（5日龄）、72h（6日龄）、96h（7日龄）及120h（8日龄）有荧光蛋白表达的活胚,经性别鉴定后,分别选取上述时间段雌、雄鸡胚各三枚（相应的正常组鸡胚）,提取全胚的RNA,并反转录为cDNA,用RT-PCR方法分析雄性鸡胚中DMRT1基因和AMH基因以及雌性鸡胚中DMRT1基因和CYP19A1基因的表达情况,结果表明:转染干扰质粒后,雄、雌鸡胚中DMRT1基因的表达水平均有下降,雄性鸡胚中AMH基因在6日龄以后的表达量与正常组相比有增加的趋势,同时各个日龄段雌性鸡胚中的CYP19A1基因的表达水平较正常组的高。本研究成功建立了鸡胚中RNA干扰方法,可以用于后续性别决定和性别分化相关基因功能的研究。同时,本研究建立的种蛋开窗方法将为鸡胚的卵内操作提供更多的便利。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 种蛋开窗处理的研究进展
• 1.2.1 开窗部位
• 1.2.2 开窗方法
• 1.3 将干扰载体导入鸡胚的方法
• 1.3.1 电穿孔转染法
• 1.3.2 脂质体介导法
• 1.3.3 病毒载体法
• 1.4 干扰效果的检测
• 1.5 用于验证干扰效果的基因的研究进展
• 1.5.1 DMRT1基因
• 1.5.2 芳香化酶基因（Cytochrome P450 19A1,CYP19A1）
• 1.5.3 抗中肾旁管激素（Anti-Mullerian Hormone,AMH）
• 2 研究的目的及意义
• 3 鸡胚中RNAI方法的建立
• 3.1 试验材料
• 3.2 主要试剂及配制
• 3.3 主要仪器与设备
• 3.4 主要分子生物学软件
• 3.5 主要数据库
• 3.6 主要研究方法
• 3.6.1 空载干扰质粒的小量提取（碱裂解法）
• 3.6.2 空载干扰质粒的大量制备
• 3.6.3 种蛋的孵化
• 3.6.4 种蛋的开窗处理及分组
• 3.6.5 将空载干扰质粒载体转染鸡胚
• 3.6.6 封口
• 3.6.7 检测
• 3.6.8 统计分析
• 3.7 结果与分析
• 3.7.1 种蛋的不同开窗方法效果比较
• 3.7.2 空载干扰质粒载体转染鸡胚
• 3.8 讨论
• 3.8.1 赤道面开窗方法的研究
• 3.8.2 不同开窗处理方法对鸡胚的影响
• 3.8.3 开窗导致种蛋孵化率下降原因分析
• 3.8.4 鸡胚转染
• 3.8.5 检测
• 3.9 小结
• 4 利用DMRT1基因检测RNAI方法在鸡胚中的干扰效果
• 4.1 试验材料
• 4.2 主要试剂及配制
• 4.3 主要分子生物学软件
• 4.4 试验方法
• 4.4.1 干扰载体的构建
• 4.4.2 干扰载体转染鸡胚
• 4.4.3 活体成像系统下检测鸡胚的转染情况
• 4.4.4 鸡胚的性别鉴定
• 4.4.5 鸡胚总RNA的提取
• 4.4.6 Real-time定量PCR分析基因表达
• 4.4.7 统计分析
• 4.5 结果
• 4.5.1 干扰载体的构建与鉴定
• 4.5.2 双重PCR鉴定鸡的性别
• 4.5.3 总RNA的提取及质量检测
• 4.5.4 cDNA质量的检测
• 4.5.5 基因引物质量的检测
• 4.5.6 荧光定量RT-PCR结果
• 4.6 讨论
• 4.6.1 shRNA的设计及重组质粒的构建
• 4.6.2 基因组DNA质量对性别鉴定的影响
• 4.6.3 鸡胚RNA样的保存及RNA的提取、检测
• 4.6.4 样本的采集
• 4.6.5 雄性鸡胚中DMRT1和AMH基因的表达关系
• 4.6.6 雌性鸡胚中DMRT1和CYP19A1基因的表达关系
• 4.7 小结
• 5 结论
• 5.1 本研究的主要结果
• 5.2 本研究的不足和进一步研究的内容
• 参考文献
• 附录
• 致谢