鸭疫里氏杆菌体内诱导抗原基因的筛选与应用研究

论文摘要

鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌（Riemerella anantipestifer,RA）引起的一种高致病性、接触性传染病,呈急性或慢性败血症,主要病理变化表现为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪型输卵管炎和脑膜炎。常给养鸭业造成巨大的经济损失,并呈世界性分布,是危害养鸭业的主要传染病之一。目前对RA的毒力因子和致病机理知之甚少。病原菌感染机体后体内诱导表达的抗原通常与病原菌的致病机制密切相关。为了研究RA感染机体过程中存在的致病因子,本研究提取了I型RA云梦株的基因组,用限制性内切酶Sau3AI酶切并回收1～4Kb的片段,将酶切回收片段与用BamHI酶切的表达载体pET28a/b/c连接后,转化大肠杆菌BL21,成功构建了RA基因组文库,库容量约3×104个。用经体外培养的RA和BL21吸附后的感染鸭血清做探针,通过体内诱导抗原技术,筛选RA的基因组表达文库,得到了28个阳性克隆,它们可能为RA在感染鸭体内诱导表达的新基因,通过生物信息学软件对这些新基因的功能进行了预测和分类,涉及RA生物合成和代谢、信号转导、分泌途径、毒力质粒等方面,这些基因可能编码与RA感染密切相关的蛋白质。本研究为RA致病机制的研究、新疫苗和诊断试剂的开发提供了一种新方法。设计引物并成功扩增了ive-1、ive-2、ive-6等3个新基因,大小分别为:537bp、1062bp和933bp,对它们进行测序、推导氨基酸序列、分析其抗原性和二级结构。并将每个克隆连接到pGEX-KG载体构建原核表达质粒,用IPTG成功诱导了各个抗原在大肠杆菌BL21中的高效表达,重组蛋白的分子量大小分别为46KDa、66KDa、60KDa。同时用吸附过的感染血清作探针,对这3个新蛋白进行了免疫学活性研究,结果显示它们具有良好的免疫学活性,初步确证这些蛋白为RA感染过程中诱导表达的抗原基因,对RA感染的致病机制研究有重要意义。以纯化的两个抗原蛋白Ive-2、Ive-6为包被抗原,成功建立了两个间接ELISA方法,结果表明它们均具有良好的重复性、特异性和敏感性。两个间接ELISA对早期感染血清和灭活苗免疫血清的检测结果进一步证实Ive-2是感染早期体内特异性表达的抗原,为以后建立一种RA感染的早期鉴别诊断方法奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 鸭疫里氏杆菌的研究进展
• 1.1 RA病原学研究
• 1.1.1 分类地位
• 1.1.2 血清型
• 1.1.3 生物学特性
• 1.2 RA的分子生物学研究
• 1.3 RA的致病因子和免疫原性相关因子研究
• 1.4 RA的流行病学研究
• 1.5 RA诊断方法研究
• 1.5.1 临床诊断
• 1.5.2 分离鉴定
• 1.5.3 琼脂凝胶免疫扩散试验
• 1.5.4 凝集试验
• 1.5.5 荧光抗体法
• 1.5.6 PCR快速检测法
• 1.5.7 间接血凝试验
• 1.5.8 间接免疫酶组织化学法
• 1.5.9 间接ELISA法
• 1.6 RA防治研究
• 1.6.1 药物防治
• 1.6.2 疫苗防治
• 2 细菌毒力基因体内表达检测系统研究进展
• 第二章 鸭疫里氏杆菌基因组表达文库的构建和鉴定
• 1 研究目的和意义
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和载体
• 2.1.2 工具酶及主要试剂
• 2.1.3 主要溶液的配制
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 鸭疫里氏杆菌的培养
• 2.2.2 鸭疫里氏杆菌基因组DNA的提取
• 2.2.3 Sau3AI最佳酶切浓度的确定
• 2.2.4 RA基因组的酶切及纯化
• 2.2.5 重组质粒的克隆和鉴定
• 3 实验结果与分析
• 3.1 鸭疫里氏杆菌的培养
• 3.2 鸭疫里氏杆菌基因组DNA的提取
• 3.3 鸭疫里氏杆菌基因组DNA的部分酶切
• 3.3.1 RA基因组DNA最佳酶切浓度的确定
• 3.3.2 RA基因组DNA的部分酶切和回收
• 3.4 表达文库的构建和质量鉴定
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 第三章 RA基因组表达文库的免疫筛选和IVI基因的初步分析
• 1 研究目的和意义
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验材料和试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要溶液的配制
• 2.1.3 主要仪器和设备
• 2.1.4 实验动物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 感染血清的制备
• 2.2.2 去除感染血清中交叉反应的抗体
• 2.2.3 RA基因组表达文库的筛选
• 2.2.4 体内诱导抗原基因序列的测定及功能预测
• 3 实验结果与分析
• 3.1 感染血清的制备及吸附处理
• 3.2 RA基因组表达文库的筛选
• 3.3 体内诱导抗原基因的测序和功能预测
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 第四章 抗原基因的克隆与表达
• 1 研究目的和意义
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与载体
• 2.1.2 主要试剂及溶液
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物的设计与合成
• 2.2.2 PCR扩增
• 2.2.3 PCR产物的回收
• 2.2.4 重组克隆质粒的构建和鉴定
• 2.2.5 原核表达质粒的构建和鉴定
• 2.2.6 转化表达菌株BL21（DE3）
• 2.2.7 诱导表达
• 2.2.8 表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.2.9 Western-blot检测
• 3 实验结果及分析
• 3.1 PCR扩增结果
• 3.2 重组克隆质粒的酶切鉴定
• 3.3 序列测定及分析
• 3.4 原核表达质粒的酶切鉴定
• 3.5 SDS-PAGE凝胶电泳结果
• 3.6 Western-blot分析
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 第五章 血清1型鸭疫里氏杆菌ELISA抗体检测方法的初步建立
• 1 研究目的和意义
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 血清与酶标抗体
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 蛋白纯化相关试剂的配制
• 2.1.4 ELISA相关溶液的配制
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 抗原的准备
• 2.2.2 间接ELISA最佳工作条件的确定
• 2.2.3 间接ELISA测定的基本试验步骤
• 2.2.4 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
• 2.2.5 重复性试验
• 2.2.6 特异性试验
• 2.2.7 符合率试验
• 2.2.8 早期感染血清的检测
• 2.2.9 临床血清样品的检测
• 3 实验结果与分析
• 3.1 蛋白可溶性与不可溶性分析
• 3.2 重组蛋白的纯化
• 3.3 最佳工作条件的确定
• 3.3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定
• 3.3.2 酶标二抗工作浓度的确定
• 3.4 阴阳性临界值的确定
• 3.5 重复性实验
• 3.6 特异性实验
• 3.6.1 交叉试验
• 3.6.2 阻断试验
• 3.7 符合率试验
• 3.8 早期感染血清的ELISA结果
• 3.9 临床血清样品的检测结果
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录