论文摘要
1997年，O’Reilly从小鼠内皮细胞瘤中分离到一种新的20kD，能特异性抑制血管内皮细胞生长的抑制因子——Endostatin。通过N端18个氨基酸序列测定结果表明该物质为胶原ⅩⅧC末端水解片段，能抑制内皮细胞的增殖和迁移，进而抑制新生血管形成，从而抑制肿瘤生长或转移。在本文中，我们首先对阳性克隆（含有hEndostatin的酵母GS115 His+Mut+）发酵目的蛋白的表达条件进行了研究。本文中试验了流加甲醇、甲醇+甘油（2：1）两种补料方式：发酵过程中补加甲醇，发酵罐OD600为795.8，目的蛋白表达量为71.0mg／L；补加甲醇+甘油（2：1）发酵罐OD600为799.1，目的蛋白表达量为80.1mg／L。发酵液上清经过浓缩、透析，直接用SP Sepharose FF阳离子柱梯度洗脱纯化，最终得到高纯度的rhEndostatin（高效液相分析纯度97％）且收率高达87％。获得rhEndostatin后，我们从体外、体内研究其生物学活性并对它进行客观评价。在体外，rhEndostatin对肿瘤细胞B16、SGC-7901、HL60增殖无抑制作用；对血管内皮细胞HMEC增殖有一定的抑制作用，对原代脐静脉血管内皮细胞HUVEC增殖有明显的抑制作用，且有良好的量效关系，EC50为160.8μg／ml；对内皮细胞HMEC、HUVEC迁移都有明显的抑制作用，其EC50分别是10.5、1.7μg／ml。在体内，rhEndostatin 8、2、0.5mg／kg静脉给药治疗S180肉瘤的抑瘤率分别为49.49、34.69、22.96％；治疗H22肝癌的抑瘤率分别为44.81、30.05、17.49％：治疗人Bel-7402肝癌的抑瘤率分别为52.03、33.78和18.24％；治疗宫颈癌Hela细胞的抑瘤率分别为68.00、46.50和24.50％；治疗胃癌SGC-7901细胞株的抑瘤率分别为51.89、40.57和16.98％；治疗H22腹水瘤小鼠，能延长腹水瘤小鼠的生命；联合化疗药CTX，抑瘤率高达95.52％，且毒副反应明显减少。我们采用竞争抑制性ELISA Kit检测小鼠血清中的rhEndostatin浓度来研究其在小鼠体内药物代谢动力学。小鼠单次静脉注射1.5，4.5mg／kg rhEndostatin浓度按三房室模型迅速衰减，末端相消除半衰期分别为9.1、10.2hr。AUC分别为2733、7425ng.h／ml。全身清除率CLS不随剂量增加而减慢。因此在注射剂量范围内表现为线性药代动力学：皮下注射1.5、4.5mg／kg rhEndostatin后浓度曲线用一级吸收二房室最佳拟合，药物吸收较快，Cmax分别为190、571ng／ml，AUC分别为1794、5843ng.h／ml与静脉注射比较生物利用度分别为65.6、78.7％：每天静脉注射1.5mg／kg rhEndostatin1次，连续7天，连续注射第7次1 hr后的血清中rhEndostatin浓度高于首次注射后相同时间点浓度。各注药间隔的AUC0-24hr：首次注射后为2936ng.h／ml，第7次注射后为4719ng.h／ml；而蓄积因子(AUC第7次／AUC第1次)为1.6，连续注射1.5mg／kgrhEndostatin存在着药物的蓄积升高。在毒理方面，小鼠一次性静脉注射rhEndostatin的LD50及一次性腹腔注射的LD50均大于500mg／kg：rhEndostatin尾静脉注射给药豚鼠，过敏试验为阴性结果。本论文初步探讨酵母表达的rhEndostatin的发酵、纯化、药效、药代、毒理等临床前研究工作，为将来的人体临床实验奠定了理论基础。rhEndostatin作为血管抑制剂是以血管内皮细胞为靶向，内皮细胞具有相对稳定性，不易产生耐药，因而抗血管生成剂必将在治疗肿瘤方面有广阔的前景。