甘肃肉羊新品种群高繁殖力候选基因GnRHR、GDF9和BMP15多态性及其与繁殖力关系的研究

论文摘要

本研究以204只甘肃肉羊新品种选育群羊和32只无角陶赛特羊为研究素材,以GDF9、BMP15、GnRHR基因的多态性为研究内容,采用PCR-SSCP技术并结合DNA测序技术分析了新品种选育群羊GDF9、BMP15基因的外显子1和2,以及GnRHR基因的外显子2和3在新品种选育群羊中的多态性,并探讨了候选基因与新品种选育群羊产羔数之间的关系,为下一步采用分子标记辅助选择进行甘肃肉羊新品种育种提供可借鉴的遗传学资料,具体研究结果如下：1.建立了检测绵羊GDF9基因、BMP15（GDF9B）基因、GnRHR基因突变的最佳PCR-SSCP方法,摸索出了三个候选基因最佳PCR-SSCP条件。2.对于引物1扩增BMP15基因外显子1,在新品种选育群羊检测到AA、AB、BB基因型,其基因型频率分别为0.618（126）、0.328（67）、0.054（11）,而无角陶赛特羊只检测到AA基因型。引物1多态片段测序分析表明：BMP15基因外显子1的246bp（cDNA28bp）缺失了3个碱基CTT。造成了被翻译的氨基酸序列的信号肽中减少了一个亮氨酸。实验结果统计分析显示：BMP15基因外显子1中虽然存在突变位点（cDNA28bp处开始缺失了3个碱基CTT）,但该突变对新品种群羊繁殖力高低没有显著影响。3.对于引物7和引物10扩增GDF9基因外显子1和2,在新品种选育群羊GDF9基因外显子1检测到CC、CD基因型,基因型频率分别为0.946（193）、0.054（11）；GDF9基因外显子2检测到EE、EF、FF基因型,基因型频率0.701（143）、0.221（45）、0.078（16）；引物7和引物10多态片段测序分析表明：GDF基因外显子1和2,分别在编码区第260位碱基发生突变G→A,导致R变成H（精氨酸→组氨酸）；第994位碱基发生突变G→A,导致V变成I（缬氨酸→异亮氨酸）。GDF基因外显子1突变对新品种群羊繁殖力高低影响显著,突变杂合基因型（CD）绵羊平均产羔数比野生纯合型（CC）多0.733只（P=0.038<0.05）,而位于外显子2的突变对新品种群羊繁殖力高低没有显著影响（P>0.05）。4.对于引物12和引物13扩增GnRHR基因外显子2和3,在新品种选育群羊GnRHR基因外显子2检测到GG、GH、HH基因型,基因型频率为0.784（160）、0.206（42）、0.010（2）;GnRHR基因外显子3检测到MM、MN基因型,基因型频率为0.882（180）、0.118（24）；引物12和引物13多态片段测序分析表明：GnRHR基因外显子2和3,分别在编码区第198位碱基发生突变G→C,导致G变成R（甘氨酸→精氨酸）；第257位碱基发生突变A→G,导致Q变成R（谷氨酰胺→精氨酸）。GnRHR基因外显子2突变对新品种群羊繁殖力高低影响极显著,突变纯合基因型（HH）绵羊平均产羔数比野生纯合型（GG）多0.981只（P=0.006<0.01）,外显子3突变对新品种群羊繁殖力高低也有显著影响。MN基因型羊平均产羔数分别比MM基因型多0.688只（P=0.029<0.05）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.国内外肉羊生产的现状
• 1.1 国外肉羊生产的现状
• 1.2 我国肉用羊的生产现状
• 2.甘肃现代肉羊新品种选育群概况
• 3.GDF9基因、BMP15基因和GNRHR基因的研究进展
• 3.1 GDF9基因的研究
• 3.1.1 生长分化因子9的结构和功能
• 3.1.2 生长分化因子9基因结构
• 3.1.3 生长分化因子9基因的定位和多态性
• 3.1.4 生长分化因子9基因与哺乳动物繁殖性能的关系
• 3.2 BMP15基因的研究
• 3.2.1 BMP15的结构和功能
• 3.2.2 BMP15基因结构
• 3.2.3 BMP15基因定位
• 3.2.4 BMP15基因与哺乳动物繁殖性能的关系
• 3.3 GnRHR基因的研究
• 3.3.1 GnRHR基因结构、功能及定位
• 3.3.2 GnRHR基因与动物繁殖性能的关系
• 4.PCR-SSCP技术的研究进展
• 4.1 PCR-SSCP方法的原理
• 4.2 PCR-SSCP的自身特点
• 4.3 PCR-SSCP方法的应用
• 5.研究的目的和意义
• 第二章 甘肃肉羊新品种群羊GNRHR、BMP15和GDF9基因多态性检测及群体遗传学分析
• 1.材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 分析软件
• 1.5 有关试剂和溶液的配制
• 2.主要试验步骤
• 2.1 基因组DNA的提取及检测
• 2.1.1 基因组DNA的提取
• 2.1.2 DNA质量及浓度检测
• 2.2 GDF9、BMP15和GnRHR基因PCR扩增
• 2.2.1 引物的设计
• 2.2.2 引物的稀释
• 2.2.3 PCR反应体系和最佳PCR扩增条件
• 2.3 GDF9、BMP15和GnRHR基因的SSCP分析
• 2.3.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳
• 2.3.2 硝酸银染色
• 2.3.3 等位基因的辨型
• 2.4 基因的克隆测序
• 2.4.1 目的片段的回收
• 2.4.2 连接反应
• 2.4.3 感受态细胞的制备—氯化钙法
• 2.4.4 转化
• 2.4.5 质粒DNA的小规模提取—碱裂解法
• 2.4.6 重组质粒的鉴定
• 2.5 序列的分析方法
• 3. 群体遗传学研究方法
• 3.1 基因频率
• 3.2 基因型频率
• 3.3 基因位点Hardy-Weinberg平衡状态的检验
• 3.4 群体遗传杂合度和遗传纯合度
• 3.5 有效等位基因数（Effective number of alleles）
• 3.6 多态信息含量（Polymorphic information content,PIC）
• 3.7 BMP15基因、GDF9基因、GnRHR基因与新品种群羊繁殖力关系的研究
• 4. 结果与分析
• 4.1 血样基因组DNA提取结果
• 4.2 GDF9、BMP15和GnRHR基因PCR扩增结果
• 4.3 GDF9、BMP15和GnRHR基因PCR-SSCP检测结果
• 4.4 不同基因型个体测序结果及其序列分析
• 4.5 突变位点的群体遗传学结果
• 4.5.1 等位基因频率、基因型频率及Hardy-Weinberg平衡状态的检验
• 4.5.2 群体遗传纯合度（Ho）、杂合度（He）、有效等位基因数及多态信息含量（PIC）分析
• 4.5.3 BMP15、GDF9和GnRHR基因多态位点与新品种群羊产羔数的关联分析
• 5. 讨论
• 5.1 GDF9基因、BMP15基因、GnRHR基因作为遗传标记的可行性讨论
• 5.2 SSCP分析方法的可靠性讨论
• 5.3 关于血液样品保存及基因组DNA的提取
• 5.4 PCR扩增反应需注意的问题
• 5.4.1 引物的设计
• 5.4.2 模板的质量
• 5.4.3 引物的浓度
• 5.4.4 PCR反应的退火温度
• 5.5 影响PCR-SSCP检测的因素
• 5.5.1 PCR扩增片段的长度
• 5.5.2 聚丙烯酰胺凝胶成分
• 5.5.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳温度和电压
• 5.5.4 SSCP结果的分析
• 5.6 GDF9、BMP15和GnRHR基因群体遗传特性的分析
• 5.7 检测结果对新品种群羊产羔数影响的分析
• 6. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介
• 附录:相关基因测序结果