论文摘要
目的新生儿细菌性脑膜炎是中枢神经系统最严重的疾病之一,其发病率和致死率都很高,临床上尽管有针对细菌的抗生素和相关的支持疗法,但仍有5%～40%患儿的死亡,存活患儿中30%留有永久性神经系统后遗症,诸如癫痫、智力和运动障碍等后遗症。大肠杆菌K1株（Escherichia coli K1,E.coli K1）是引起新生儿细菌性脑膜炎最常见的革兰氏阴性致病菌。大肠杆菌性脑膜炎一般是由于细菌的血行播散引起的。大肠杆菌穿过血脑屏障是多因素参与的过程,血液中大肠杆菌穿过血脑屏障的主要组成部分—人脑微血管内皮细胞（Human brain microvascularendothelial cell,HBMEC）是很关键的环节。然而,这一过程的机制还不是很清楚。因此,了解大肠杆菌穿过血脑屏障的分子机制可望为新生儿细菌性脑膜炎的防治提供新的干预靶点。血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）是由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞组成的结构和功能性屏障。它能够调节分子进出大脑从而维持中枢神经系统微环境的稳定,并且将中枢神经系统的微环境与外周循环系统分隔开来。血脑屏障具有调节离子流和供给营养成分进入脑内的能力,其特点是限制细胞间扩散,减少胞吞作用和离子、多肽、营养成分特殊运载体的出现,这使得中枢神经系统的稳定性受到严密控制。人脑微血管内皮细胞（HBMEC）是构成血脑屏障的主要结构,它可阻止多种物质入脑,但营养物质和代谢产物可顺利通过,以维持中枢神经系统内环境的相对稳定。体外分离培养的HBMEC就成为研究血脑屏障功能的理想对象。Src是最早报道的癌基因,与后来发现的其他癌基因有共同特点。反转录病毒基因v-Src具有致癌性,其同源的原癌基因c-Src是人或动物细胞中的正常基因,它们编码分子量为60kDa的非受体酪氨酸激酶。Src与细胞的生长、存活、分化、形态、迁移、信号传导、细胞周期调控都密切相关。Src的功能是通过磷酸化来实现的,底物蛋白直接或间接通过Src酪氨酸激酶磷酸化。Src底物最初发现在转化细胞,多数位于粘着斑,是整合素介导的信号通路的重要成分。他们是与肌动蛋白和整合素绑定在一起的,例如:vinculin、cortactin、talin、paxillin、FAK、tensin、ezrin和p130cas。此外,连接蛋白具有能通过Src激酶酪氨酸磷酸化的主要位点,例如β-和γ-catenin、ZO一1、occludin、p120ctn、connexin 43和nectin。本研究室的前期工作发现:PI3K是参与E.coli K1侵袭HBMEC的重要信号分子。PI3K→p-Akt→LIMK→Cofili信号通路可以启动细胞骨架的重排,增加E.coliK1对HBME的侵袭,而PI3K→Rock→LIMK→p-Cofilin信号通路能抑制E.coli K1对HBMEC的侵袭,但PI3K的上游信号通路还不清楚。近来研究表明,表皮生长因子刺激T47D细胞导致Src蛋白酪氨酸激酶活化,Src活化后通过Src→c-Cbl→PI3K→Akt信号通路调节Akt的活化。Src激酶还可以通过激活PI3K信号通路调节结肠癌细胞的失巢凋亡。因此我们探讨Src家族激酶是否参与E.coli K1对HBMEC的侵袭并且是否是PI3K/Akt的上游信号分子。本研究利用HBMEC体外模拟血脑屏障,观察E.coli K1侵袭HBMEC过程中细菌的侵袭和粘附能力、侵袭后HBMEC细胞骨架变化。本研究对E.coli K1侵袭HBMEC过程中Src家族蛋白酪氨酸激酶相关信号转导通路进行了研究,为探讨致病性大肠杆菌感染真核宿主细胞的分子机制提供了新的线索。方法一、E.coli K1侵袭人脑微血管内皮细胞过程中Src激酶的活化1.细胞培养:HBMEC细胞培养于含10%胎牛血清,10%Nu血清的RPMI1640培养液。2.Western Blot方法:检测E.coli K1侵袭HBMEC的过程中Src的磷酸化。3.细菌侵袭实验:检测Src激酶抑制剂预处理后,E.coli K1对HBMEC的侵袭情况。4.细菌粘附实验:检测Src激酶抑制剂预处理后,E.coli K1对HBMEC的粘附情况。5.荧光技术:观察Src激酶抑制剂预处理后,E.coli K1侵袭后HBMEC的细胞骨架变化。6.转染技术:利用Lipofectamine2000将稳定表达dominant-negative Src（Srcdn）的pEGEP-Srcdn质粒稳定转染到HBMEC,G418筛选,建立稳定表达Srcdn的细胞株。7.Western Blot方法:检测E.coli K1侵袭稳定表达Srcdn的HBMEC后Src的磷酸化情况。8.细菌侵袭实验:检测E.coli K1对稳定表达Srcdn的HBMEC的侵袭情况。二、E.coli K1侵袭人脑微血管内皮细胞过程中Src激酶介导的信号通路1.Western Blot方法:检测Src激酶抑制剂预处理后,E.coli K1侵袭HBMEC的过程中Akt的磷酸化情况。检测E.coli K1侵袭转染dominant-negative Src（Srcdn）的HBMEC后Akt的磷酸化情况。检测PI3K激酶抑制剂的预处理后,E.coli K1侵袭HBMEC的过程中Src的磷酸化情况。检测E.coli K1侵袭转染dominant-negative PI3K（△p110）的HBMEC后Src的磷酸化情况。2.免疫沉淀方法:检测E.coli K1侵袭HBMEC后Src和p85之间的相互作用情况。3.免疫荧光方法:检测Src与p85在E.coli K1侵袭HBMEC过程中的共定位（共聚焦）。三、Flt1受体可能参与Src介导的E.coli K1侵袭脑微血管内皮细胞的过程1.免疫沉淀方法:检测E.coli K1侵袭HBMEC后Src、p85和Flt-1三者之间的相互作用。2.细菌侵袭实验:检测VEGF受体特异性抑制剂（SU5416和KRN633）或KDR特异性抑制剂预处理后,E.coli K1对HBMEC的侵袭。3.细菌侵袭实验:检测E.coli Kl对Flt-1干扰细胞的侵袭情况。4.Western Blot方法:检测E.coli K1侵袭干扰Flt-1细胞后Akt的磷酸化情况。结果一、E.coli K1侵袭人脑微血管内皮细胞过程中Src激酶的活化1.E.coli K1侵袭HBMEC后能引起Src激酶的磷酸化。E.coli K1侵袭HBMEC不同时间（0min、5min、15min和30min）,并且在侵袭15min时达到最高。2.Src激酶抑制剂预处理能够降低E.coli K1对HBMEC的侵袭,但不影响E.coliK1对HBMEC的粘附。（1） Src激酶抑制剂PP1或PP2（1-20umol/L）预处理后,E.coli K1对HBMEC的侵袭明显降低,呈剂量依赖式。Src激酶抑制剂类似物PP3（1-20umol/L）预处理后,E.coli K1对HBMEC的侵袭没有影响。（2） Src激酶抑制剂PP1或PP2（1-20umol/L）预处理不影响E.coli K1对HBMEC的粘附。Src激酶抑制剂类似物PP3（1-20umol/L）预处理后,E.coli K1对HBMEC的粘附没有影响。3.Src激酶抑制剂预处理能够降低E.coli K1侵袭HBMEC后所引起的Src磷酸化。HBMEC用PP1和PP2（10umol/L）预处理30min,E.coli K1侵袭15min后发现pSrc表达明显降低;但用PP3（10umol/L）预处理HBMEC30min,E.coli K1侵袭15min后发现pSrc表达不降低。4.HBMEC中dominant-negative Src（Srcdn）的表达能降低E.coli K1对HBMEC的侵袭但不影响E.coli K1对HBMEC的粘附。5.HBMEC中Srcdn的表达能降低E.coli K1侵袭HBMEC后所引起的Src磷酸化。6.Src激酶参与E.coli K1侵袭HBMEC引起的细胞微丝改变。E.coli K1侵袭HBMEC后可引起肌动蛋白微丝聚集、肌动蛋白吞噬杯形成等肌动蛋白细胞骨架重排的动力学改变。HBMEC经PP1和PP2（10umol/L）预处理30min,E.coli K1侵袭30min后不能观察到肌动蛋白微丝聚集;但经PP3（10umol/L）预处理30min,E.coli K1侵袭30min后仍能观察到肌动蛋白微丝聚集。7.E.coli K1侵袭转染Srcdn的HBMEC后,不能引起细胞肌动蛋白微丝聚集。二、E.coli K1侵袭人脑微血管内皮细胞过程中Src激酶介导的信号通路1.Src激酶抑制剂预处理显著降低E.coli K1侵袭HBMEC引起的Akt的磷酸化。HBMEC用PP1或PP2（10umol/L）预处理30min,E.coli K1侵袭15min后pAkt的表达不变;而相同浓度PP3预处理,E.coli K1侵袭15min后pAkt的表达升高。2.E.coli K1侵袭转染Srcdn的HBMEC后,降低了E.coli K1侵袭HBMEC引起的Akt磷酸化。3.PI3K抑制剂预处理对E.coli K1侵袭HBMEC引起的Src磷酸化没有影响。HBMEC用LY294002（1umol/L）或Wortmannin（10nmol/L）预处理30min,E.coli K1侵袭15min后pSrc的表达升高,在侵袭15min达到最高。4.E.coli K1侵袭转染dominant-negative PI3K（△p110）的HBMEC后,不影响Src的磷酸化。5.E.coli K1侵袭HBMEC不同时间（0min、5min、15min和30min）后,Src与p85的相互作用增强并且在E.coli K1侵袭15min时达到最高。三、Flt1受体可能参与Src介导的E.coli K1侵袭人脑微血管内皮细胞的过程1.在E.coli K1侵袭HBMEC后,Src和p85与Flt-1可以形成复合物。E.coli K1侵袭HBMEC不同时间（0min、5min、15min和30min）,Src和p85与Flt-1的相互作用增强并且在E.coli K1侵袭15min时达到最高。2.VEGF受体特异性抑制剂预处理能够显著降低E.coli K1对HBMEC侵袭,KDR抑制剂预处理对E.coli K1侵袭HBMEC无影响。VEGF受体特异性抑制剂SU5416（1-50umol/L）或KRN633（1-48umol/L）预处理后,E.coli K1对HBMEC的侵袭明显降低,呈剂量依赖式。KDR受体特异性抑制剂预处理后,E.coli K1对HBMEC的侵袭无变化。3.干扰Flt-1后能够显著降低E.coli K1对HBMEC的侵袭。4.干扰Flt-1后能够降低E.coli K1侵袭HBMEC所引起的Akt的磷酸化。结论Src激酶参与E.coli K1侵袭人脑微血管内皮细胞过程且能引起肌动蛋白微丝的聚集。在介导E.coli K1侵袭人脑微血管内皮细胞的信号转导通路中,Src激酶是PI3K/Akt信号通路的上游信号分子。Flt-1受体有可能参与Src介导的E.coli K1侵袭人脑微血管内皮细胞的过程。
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相关论文文献
- [1].鼠李糖乳杆菌培养上清液通过抑制NF-κB通路预防大肠杆菌性脑膜炎[J]. 南方医科大学学报 2017(01)
标签：激酶论文; 大肠杆菌论文; 人脑微血管内皮细胞论文; 细胞骨架论文; 信号转导论文;