烟草普通花叶病毒株系分化研究

论文摘要

从山东、云南等8个主产烟省总共采集264个病毒样品,通过ELISA和RT-PCR对264个烟草病毒病样品进行检测分析,其中TMV检出率为91.7%,CMV检出率为18.2%,PVY检出率为55.3%。并且多数样品存在多种病毒混合侵染的现象,TMV和CMV混合侵染占6.8%,TMV与PVY混合侵染占28.8%,CMV与PVY混合侵染占2.2%,TMV、CMV和PVY三者共同侵染占19.7%。TMV危害最为普遍。将264个病毒标样接种苋色藜进行单斑分离纯化,得到264个分离物,ELISA检测表明242个分离物为TMV。将242个TMV分离物分别接种一组鉴别寄主,观察记录症状。242个TMV分离物在番茄上表现有整株黄化花叶、普通花叶和症状不明显三种症状;在辣椒上主要是表现局部枯斑和接种后不表现局部枯斑两种。将242个TMV分离物根据在番茄上的症状差异分成2组,在番茄上表现普通花叶和无明显症状的定为普通株系,在番茄上表现整株黄色花叶的定为黄化株系。从2组分离物取5个分离物(普通株系取3个分离物,黄化株系取2个分离物,通过对5个分离物病叶的总RNA提取,利用TMV 3对特异性引物对其进行RT-PCR扩增,结果显示5个分离物均能扩增出PCR条带,片段大小约为2300 bp,片段大小约为2000 bp,片段大小约为2500 bp,片段大小与设计预期相符,条带单一。将PCR产物直接送去测序,结果表明5个分离物TMV全长均为6395 bp,存在3个编码框,分别编码183 kaD复制酶蛋白,30 kaD外壳蛋白和17.6 kDa运动蛋白。利用DNAMAN软件,将5个TMV分离物的复制酶蛋白、MP、CP序列以及全序列分别和GenBank中已有的TMV分离物相应序列进行序列比对和系统进化分析,结果表明已有的TMV分离物主要划分为两大亚种群,即以TMV-OM株系为代表的亚种群Ⅰ和以TMV-U株系为代表的亚种群Ⅱ。本研究所获得的5个TMV分离物全序列均聚为一簇,属于亚种群Ⅱ。5个分离物CP氨基酸序列相似性均为99%,参照Shukla和Ward提出了Potyirus的划分标准,5个分离物应归为一个株系。XF-4和XF-4-1两个分离物复制酶氨基酸序列、MP氨基酸序列、CP氨基酸序列相似性都很高,而且这两个分离物的氨基酸全序列与其他亚种群Ⅱ的氨基酸全序列相似性仅为95%,这两个分离物很可能为亚种群Ⅱ的一个新株系。通过分析5个TMV分离物各自3个蛋白的变异特征,表明我国TMV存在一定的分子变异,且主要表现为点突变,无缺失和插入突变。同时本研究还表明我国TMV株系分化存在地理间隔特征,不同地理来源的TMV分离物在序列变异特征上存在一定差异,同一地区或相同生态类型区域的TMV分离物在亲缘关系上较近。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 烟草普通花叶病毒（TMV）简介
• 1.1.1 TMV 的危害情况
• 1.1.2 TMV 基因组
• 1.2 TMV 病毒株系研究概况
• 1.2.1 已经报道的TMV 株系
• 1.2.2 株系研究方法
• 1.2.3 病毒株系研究意义
• 1.2.4 RNA 病毒的变异
• 第二章 病毒样品的采集与检测
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 试验结果与分析
• 2.2.1 病毒标样的ELISA 检测结果
• 2.2.2 TMV、CMV 和PVY 单一RT-PCR 检测体系的验证
• 2.2.3 TMV、CMV 和PVY 多重RT-PCR 体系的建立
• 2.2.4 多重RT-PCR、单一PCR 和ELISA 的比较应用
• 2.2.5 烟草叶片水提物提取检测与鉴定
• 2.3 讨论
• 2.3.1 全国烟草主要病毒病发生特点与流行规律
• 2.3.2 烟草病毒检测体系
• 2.3.3 利用水提物快速简便检测烟草中TMV 的方法
• 2.4 结论
• 第三章 TMV 病毒样品的分离鉴定与株系分化研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 TMV 样品单斑分离纯化鉴定
• 3.2.2 TMV 株系生物学分化研究
• 3.3 讨论
• 3.3.1 TMV 株系分化
• 3.4 结论
• 第四章 TMV 的全长序列分析与分子变异
• 4.1 试验材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 总RNA 提取结果
• 4.2.2 TMV 全长基因组RT-PCR 扩增
• 4.2.3 TMV 全长序列分析
• 4.2.4 TMV 复制酶基因系统进化分析
• 4.2.5 TMV 运动蛋白（MP）系统进化分析
• 4.2.6 TMV CP 系统进化分析
• 4.2.7 5 个不同TMV 分离物的同源性与系统进化分析
• 4.3 讨论
• 4.4 结论
• 第五章 讨论及结论
• 5.1 病毒株系分类标准的讨论
• 5.2 结论
• 5.2.1 TMV 发生危害情况与株系分化
• 5.2.2 多重RT-PCR 病毒检测体系
• 5.2.3 利用烟草叶片水提物检测烟草TMV
• 5.2.4 初步明确了我国TMV 的分子变异
• 5.3 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 附表