少根根霉直接发酵木薯粉产富马酸的研究

论文摘要

富马酸别名延胡索酸，化学名称为反丁烯二酸。作为一种四碳二元酸，富马酸在医药、食品、化工、树脂等领域有广泛应用。本文以实验室保藏的少根根霉作为发酵的原始菌株，通过溴甲酚绿和丙烯醇平板的复壮筛选得到优良菌株少根根霉（Rhizopus arrhizus）RH-7-13。利用该菌的糖化淀粉能力，省去常规发酵的原料糖化处理，开发了以廉价原料木薯粉为碳源的两步发酵工艺。通过气升式发酵罐的小试发酵实验，得到了较高的富马酸产量，达42.32g/L。通过对种子培养条件的正交试验，找到了少根根霉种子培养阶段形成小球的最佳条件：尿素浓度1.5g/L，接种的孢子密度为6.2×107个/mL，pH2.5。由于菌种退化，原始菌株的富马酸产量不足20g/L。因此，对原始菌株进行了复壮筛选。经过溴甲酚绿和丙烯醇平板筛选，得到菌株少根根霉（Rhizopus arrhizus）RH-7-13，富马酸的产量可达39.63g/L。木薯乃世界三大薯类之一，在我国广西地区广泛种植。干木薯的淀粉含量高，可达75%。少根根霉的糖化能力强，工业上可作为酿酒的固体曲。本文采用实验室所存少根根霉（Rhizopus arrhizus）RH-7-13直接发酵木薯粉产富马酸。通过对发酵培养基的六种成分（木薯粉、尿素、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、FeSO4）Plackeet-Burman（PB）实验，筛选出木薯粉和KH2PO4是影响富马酸产量的显著影响因素。采用CCD设计，对木薯粉和KH2PO4进行了响应面优化。最佳的培养基组成如下：木薯粉84.14g/L、尿素0.05g/L、 KH2PO41.55g/L、 MgSO4·7H2O0.5g/L、ZnSO4·7H2O0.025g/L、FeSO45.0×10-4g/L。并研究了木薯粉细度、接种量、装液量、中和剂碳酸钙添加量对富马酸发酵的影响。富马酸产量可以达到46.36g/L，时空产率可以达到0.32g/L/h。少根根霉菌丝发达，在搅拌式反应器中容易结团并缠绕搅拌桨。本文采用容积为2.5L自制气升式反应器（通气量1.54vvm、温度30℃、装液量1.3L/2.5L），富马酸产量可达42.32g/L，达到国际较高水平。时空产率可以达到0.29g/L/h。以葡萄糖为碳源，采用棉球和丝瓜瓤吸附少根根霉产富马酸，富马酸的产量分别可达29.33g/L和38.94g/L。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 富马酸简介
• 1.1.1 富马酸的理化性质
• 1.1.2 富马酸的用处
• 1.1.3 生产富马酸的途径
• 1.2 微生物发酵产富马酸
• 1.2.1 发酵法产富马酸的主要菌种
• 1.2.2 根霉合成富马酸的代谢机理
• 1.2.3 生产富马酸微生物的菌种选育
• 1.2.4 根霉种子培养阶段菌丝体形态的控制
• 1.2.5 发酵培养优化
• 1.2.6 新中和剂的研究
• 1.2.7 新发酵原料的开发
• 1.2.8 根霉固定化的研究
• 1.2.9 溶氧对根霉发酵产富马酸的影响
• 1.2.10 根霉发酵新型反应器的研究
• 1.2.11 富马酸的分离提取
• 1.3 本课题的研究内容与意义
• 1.3.1 本课题的研究思路
• 1.3.2 本课题的研究内容
• 1.3.3 本课题的研究意义
• 第二章 少根根霉菌丝体形态优化及菌种复壮
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 培养及筛选方法
• 2.2.3.1 传代培养
• 2.2.3.2 制取孢子悬浮液
• 2.2.3.3 种子培养
• 2.2.3.4 发酵培养
• 2.2.3.5 菌种复壮筛选方法
• 2.2.4 分析方法
• 2.2.4.1 富马酸
• 2.2.4.2 乙醇
• 2.2.4.3 葡萄糖
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 原始菌富马酸产量情况
• 2.3.2 少根根霉种子培养的菌丝体形态优化
• 2.3.2.1 pH 对菌丝体形态的影响
• 2.3.2.2 孢子密度对菌丝体形态的影响
• 2.3.2.3 尿素浓度对菌丝体形态的影响
• 2.3.2.4 添加氯化钙对菌丝体形态的影响
• 2.3.2.5 正交试验
• 2.3.3 筛选菌株的发酵实验
• 2.3.3.1 筛选结果
• 2.3.3.2 筛选菌株的发酵实验
• 2.4 本章小结
• 第三章 少根根霉直接发酵木薯粉产富马酸的发酵条件优化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 培养方法
• 3.2.3.1 传代培养
• 3.2.3.2 制取孢子悬浮液
• 3.2.3.3 种子培养
• 3.2.3.4 发酵培养
• 3.2.4 分析方法
• 3.2.4.1 富马酸
• 3.2.4.2 乙醇
• 3.2.4.3 葡萄糖
• 3.2.4.4 Yoo改良法测定淀粉酶酶活
• 3.2.4.5 生物量测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 以可溶性淀粉为碳源的发酵实验
• 3.3.2 不同菌株直接发酵木薯粉产富马酸的情况
• 3.3.3 氮源对直接发酵木薯粉产富马酸的影响
• 3.3.4 木薯粉量对富马酸产量的影响
• 3.3.5 Plackeet-Burman（PB）实验
• 3.3.6 CCD实验优化木薯粉和磷酸二氢钾添加量
• 3.3.7 木薯粉细度对富马酸产量的影响
• 3.3.8 中和剂碳酸钙添加量对富马酸发酵的影响
• 3.3.9 接种量对富马酸发酵的影响
• 3.3.10 溶氧对富马酸发酵的影响
• 3.3.10.1 装液量对富马酸发酵的影响
• 3.3.10.2 转速对富马酸发酵的影响
• 3.3.10.3 氧载体对富马酸发酵的影响
• 3.3.11 补充葡萄糖和可溶性淀粉对富马酸发酵的影响
• 3.3.12 少根根霉直接发酵木薯粉产富马酸淀粉酶酶活的测定
• 3.4 本章小结
• 第四章 直接发酵木薯粉产富马酸气升式反应器小试研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 培养方法
• 4.2.3.1 传代培养
• 4.2.3.2 制取孢子悬浮液
• 4.2.3.3 种子培养
• 4.2.3.4 发酵培养
• 4.2.4 分析方法
• 4.2.4.1 富马酸
• 4.2.4.2 乙醇
• 4.2.4.3 葡萄糖
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 以葡萄糖和木薯粉为碳源富马酸的摇瓶发酵过程比较
• 4.3.2 以葡萄糖为碳源的搅拌式反应器发酵实验
• 4.3.3 两种碳源气升式反应器发酵过程对比
• 4.4 本章小结
• 第五章 吸附固定化少根根霉产富马酸
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌种
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 培养方法
• 5.2.3.1 传代培养
• 5.2.3.2 制取孢子悬浮液
• 5.2.4 分析方法
• 5.2.4.1 富马酸
• 5.2.4.2 葡萄糖
• 5.2.5 棉球固定化发酵实验
• 5.2.6 丝瓜瓤固定化发酵实验
• 5.2.7 重复批次发酵实验
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 棉球固定化发酵实验
• 5.3.1.1 棉球固定化载体数目对富马酸发酵的影响
• 5.3.1.2 重复批次发酵
• 5.3.3 丝瓜瓤固定化发酵实验
• 5.3.3.1 丝瓜瓤固定化载体数目对富马酸发酵的影响
• 5.3.3.2 重复批次发酵实验
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论
• 第七章 问题与建议
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 研究成果与发表的学术论文
• 作者及导师简介
• 附件