论文摘要
目的：为从甲鱼脂肪中提取甲鱼油，富集其中的ω-3 PUFAs，并分别从细胞水平和实验动物整体水平探讨其生物活性，即分别研究ω-3 PUFAs对胰岛素抵抗HepG2细胞胰岛素敏感性及糖代谢和大鼠浅Ⅱ度烧伤创面愈合的影响。方法：实验一：采用超临界CO2萃取方法从甲鱼脂肪中提取甲鱼油，然后利用低温浓缩法富集甲鱼油中的ω-3 PUFAs，最后利用GC法测定甲鱼油中的ω-3 PUFAs的含量。实验二：利用高浓度胰岛素体外诱导方法建立HepG2胰岛素抵抗细胞模型，通过3H-D-葡萄糖参入实验鉴定该细胞模型。采用MTT方法检测细胞的增殖情况。利用甲鱼油处理模型细胞通过葡萄糖氧化酶及3H-D-葡萄糖参入实验分别检测其葡萄糖消耗和3H-D-葡萄糖参入率。实验三：将甲鱼油作用于正常大鼠皮肤表面，进行皮肤刺激试验和致敏试验。利用琼脂扩散法，通过测定金葡菌、绿脓杆菌、大肠杆菌及白色念球菌等四组的抑菌圈，判断甲鱼油对致病菌的体外抑菌效果。同时用稀释法测定甲鱼油的最低抑菌浓度MIC与最低杀菌浓度MBC。将甲鱼油应用于大鼠浅Ⅱ度烧伤创面，判断其对创面愈合及组织修复的影响。取108只Wistar大鼠随机分为单纯烧伤组、银辛霜治疗组和甲鱼油治疗组，每组36只。建立浅Ⅱ度烫伤大鼠模型，各组创面分别用银辛霜纱布、甲鱼油纱布，生理盐水纱布覆盖包扎固定。各组动物分别于伤后1，3，5，10，14天取创面组织，根据苏木精-伊红染色（HE）结果，病理组织学变化及通过免疫组织化学链霉素-卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法检测的创面组织增殖细胞核抗原表达情况判断创面愈合率及愈合时间。结果：1．从经低温干燥脱水处理的甲鱼脂肪中提取甲鱼油，得油率82.0％。经优化的萃取实验参数为：萃取压力20MPA，分离压力8MPA，萃取温度50℃，分离温度为35℃，CO2流量为2ml／g。低温浓缩法富集甲鱼油中的ω-3 PUFAs的最佳条件为温度-50℃、原料：溶剂比为1：12、冷冻时间8h，获得的ω-3PUFAs含量最高（26.39％）。2．高浓度胰岛素细胞的葡萄糖参入率在各种浓度的胰岛素刺激下均低于对照细胞（P＜0.05），并且高胰岛素细胞与对照细胞的3H-D-葡萄糖参入率随着胰岛素浓度的升高而升高，但前者升高的幅度低于后者。MTT结果显示甲鱼油均具有促进对照细胞和IR模型细胞增殖作用。与对照组细胞相比，采用不同浓度胰岛素诱导的模型细胞经甲鱼油处理后其葡萄糖摄取和消耗显著增加（P＜0.05）。3．皮肤刺激试验和致敏试验结果显示，大鼠皮肤经ω-3 PUFAs处理后无充血、水肿及溃疡等皮肤刺激现象，大鼠未见喷嚏、用爪搔鼻、呼吸困难、休克死亡等全身过敏反应，亦未见局部水肿、荨麻疹等反应。甲鱼油的体外抑菌实验结果显示，甲鱼油抑制金葡菌的最低浓度1：16，抑制大肠杆菌与白色念珠菌的最低浓度均为1：4，而对金葡萄的最低杀菌浓度为1：2，对大肠杆菌、白色念珠菌的最低杀菌浓度为1：1，但对绿脓杆菌没有抑菌和杀菌作用。甲鱼油对大鼠浅Ⅱ度烧伤创面组织愈合及修复的结果显示：（1）创面愈合时间：甲鱼油治疗组比单纯烧伤组、银辛霜治疗组明显缩短。（2）创面愈合率：甲鱼油治疗组、银辛霜治疗组比单纯烧伤组明显升高。（3）病理切片显示甲鱼油能减轻烧伤创面早期的炎症反应，组织学分析显示甲鱼油可促进创面的再上皮化和表皮各层的分化。（4）增殖细胞核抗原在创面组织标本中的表达量：甲鱼油治疗组比单纯烧伤组和银辛霜治疗组明显升高。结论：1．采用超临界CO2萃取和低温结晶方法可以从甲鱼脂肪中提取出富含ω-3 PUFAs的甲鱼油，并可通过气相色谱方法检测其含量。2．HepG2细胞置于5×10-7mol·L-1胰岛素环境中16 h，HepG2细胞对胰岛素的作用产生抵抗。即运用高胰岛素诱导培养法可以复制出稳定可靠的HepG2胰岛素抵抗细胞模型。甲鱼油明显增加该IR细胞模型的葡萄糖消耗和3H-D-葡萄糖参入率，提高胰岛素抵抗细胞模型的胰岛素敏感性，改善其糖代谢。3．甲鱼油对大鼠正常皮肤不具有皮肤刺激和致敏作用，对金葡菌、大肠杆菌及白色念珠菌具有抑菌作用，而对绿脓杆菌不具有抑制作用。甲鱼油能加速大鼠烧伤创面组织修复细胞的增殖，加快创面再上皮化，促进大鼠烧伤创面组织愈合。
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