分子佐剂通过粘膜免疫途径增强草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗抗生育效果的研究

论文摘要

草原兔尾鼠（Lagurus lagurus）属啮齿目仓鼠科田鼠亚科兔尾鼠属,是新疆荒漠草场的一种野生害鼠,对新疆荒漠草场造成巨大的损害,严重威胁着新疆畜牧业的发展。化学毒杀、诱捕、射杀等传统方法时效短、物种专一性差,对环境造成破坏,不能有效控制害鼠的种群数量。采用免疫不育技术降低有害动物的生育率是一种更人道的、物种专一性更强的防治有害动物的方法。免疫不育疫苗主要以精子或卵子蛋白以及在受精和胚胎早期发育过程中发挥重要作用的蛋白或激素为抗原。肌肉和皮下接种等免疫不育疫苗传统接种方式很难在野外施用以控制有害动物种群数量,而口服饵料等粘膜免疫方式可以对有害动物进行大量接种,是切实可行的方法。鼠卵透明带3（Zona pellucida 3）主要由3种糖蛋白（ZP1、ZP2、ZP3）组成, ZP3作为精子的初级受体,诱发顶体反应,其抗体可以阻止精卵结合,在生殖过程中起重要作用,因此成为免疫不育疫苗的理想靶抗原。DNA疫苗既能激发体液免疫,又能诱导细胞免疫,且具有制备简单、易于贮存运输等诸多优点,已被广泛地应用于免疫不育疫苗的研究中。由于DNA疫苗存在免疫原性不强,免疫效果不佳等原因,因此需要通过添加佐剂,改变发送途径,优化载体等方式来提高DNA不育疫苗的抗生育效果。为了筛选出能有效提高LZP3DNA不育疫苗抗生育效果的分子佐剂,本研究选用小鼠白细胞介素31、白细胞介素15、白细胞介素33和非细胞因子FAI3作为分子佐剂,通过粘膜免疫途径,增强草原兔尾鼠LZP3DNA不育疫苗抗生育效果。并进一步探讨细胞因子和非细胞因子FAI3作为佐剂对草原兔尾鼠卵透明带DNA不育疫苗的免疫调节作用。白细胞介素31主要由活化的Th2细胞生成,在T细胞介导的免疫反应中起重要作用,它参与了炎症和变性皮肤疾病。在遗传过敏性皮炎和接触性过敏性皮炎患者中,IL-31表达水平的增高与IL-4和IL-13具有一定的相关性。细胞因子白细胞介素33（interleukin 33,IL-33）是IL-1家族的新成员。IL-33通过IL-1受体ST2发挥其生物学功能,活化NF-kB和MAP激酶,在体外促进TH2细胞产生TH2相关细胞因子。人IL-33的表达仅限于支气管、小气道的上皮细胞、成纤维细胞以及平滑肌细胞,这暗示IL-33有可能参与了黏膜免疫。DC细胞通过ST2直接对IL-33产生应答,被IL-33活化的DC细胞触发了一种非典型的Th2型免疫反应,生成IL-5和IL-13。IL-33与DC细胞的相互作用可能代表了一种引发Th2型免疫反应的新途径。白细胞介素15是一个促炎症细胞因子,通过诱导淋巴细胞的活化、增殖,细胞因子的释放来增强体液和细胞免疫反应。IL-15充当佐剂时,能提高抗体滴度,促进DC细胞成熟。FAI（Fbrinogen/ albumin/ IgG,纤维蛋白原/白蛋白/免疫球蛋白G受体）是来自C群链球菌的一种多配基结合蛋白,它能同时结合纤维蛋白原、白蛋白和免疫球蛋白G。位于415bp-702bp处的fai3基因片段具有粘膜佐剂活性。首先克隆获得了小鼠细胞因子白细胞介素33基因、白细胞介素31基因和白细胞介素31突变体。成功构建了pcD- mIL-15、pcD- mIL31、pcD- muIL31、pcD- mIL33和pcD- fai3五种重组质粒,这五种质粒均能在真核细胞中表达相应的佐剂分子。用壳聚糖chitosan作为发送载体,chitosan同时或单独包裹DNA疫苗pcD-Lzp3和重组质粒pcD-mIL-15、pcD-mIL31、pcD-muIL31、pcD-mIL33和pcD- fai3形成不同的chitosan-DNA复合物。在第0, 14, 28和42d,分别用不同的chitosan-DNA复合物通过滴鼻免疫途径免疫ICR小鼠。间接ELISA检测血清中抗LZP3特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体,以及阴道洗液和粪便中的特异性IgA抗体。结果显示:滴鼻共免疫chi-（pcD-Lzp3+pcD-mIL-31）或chi-（pcD-Lzp3+pcD-muIL-31）都能诱导机体产生较高水平的血清IgG,降低了雌鼠的平均窝仔数。这两个共免疫组都产生较强的淋巴细胞增殖活性,激发Th1型免疫反应。共免疫chi-（pcD-Lzp3+pcD- muIL-31）不育小鼠的卵巢形态异常;在chi-（pcD-Lzp3+ pcD-mIL-31）组,不育小鼠卵巢中卵泡数量明显减少。Chi-（pcD-Lzp3+pcD-mIL-15）产生较强的淋巴细胞增殖活性。chi-（pcD-Lzp3+pcD-mIL-15）共免疫组小鼠的卵巢组织具有各级形态发育正常的卵泡,无卵巢炎的发生。滴鼻共免疫chi-（pcD-Lzp3+pcD-mIL-33）诱导产生了最高水平的血清IgG和粘膜sIgA,生育率和平均窝仔数显著降低。Chi-（pcD-Lzp3+pcD-mIL-33）共免疫组不育小鼠的卵巢组织出现了卵泡萎缩、卵母细胞丢失等异常现象。这些研究结果表明, mIL-33作为分子佐剂与DNA不育疫苗pcD-Lzp3滴鼻共免疫小鼠,能显著提高DNA不育疫苗抗生育效果,并能够诱导机体产生较强的系统体液免疫反应和粘膜免疫反应。Chi-（pcD-Lzp3+pcD-fai3）滴鼻共免疫也诱导机体生成了抗Lzp3特异性血清IgG和黏膜sIgA,生育率和平均窝仔数显著降低。共免疫组小鼠的卵巢组织具有各级形态发育正常的卵泡,无卵巢炎的发生。结果显示,fai3作为分子佐剂与DNA不育疫苗pcD-Lzp3滴鼻共免疫小鼠增强了体液免疫反应和黏膜免疫反应,提高了DNA不育疫苗的抗生育效果。在chi-（pcD-Lzp3+pcD-fai3）和chi-（pcD-Lzp3+pcD-mIL-33）共免疫组,免疫接种后不育小鼠的抗体水平显著高于生育小鼠,小鼠不育与抗体水平之间具有明显的相关性。口服免疫是不育疫苗发送的有效途径。本研究进一步探讨了小鼠白细胞介素15和FAI3作为口服粘膜佐剂增强Lzp3 DNA不育疫苗抗生育效果的可行性。将上述chitosan-DNA复合物加入鼠粮中,制成饵料,免疫ICR小鼠。结果显示,口服共免疫chi-（pcD-Lzp3+pcD-fai3）都诱导产生了较高水平的血清IgG和肠粘膜sIgA,生育率和平均窝仔数都有所下降。Chi-（pcD-Lzp3+pcD-mIL-15）免疫组产生了较强的淋巴细胞增殖活性。对卵巢切片进行组织学检测,结果显示,两个共免疫组小鼠的卵巢组织正常。综上所述,小鼠细胞因子白细胞介素33作为分子佐剂与草原兔尾鼠DNA不育疫苗pcD-Lzp3滴鼻共免疫小鼠,增强了机体的系统体液免疫反应和粘膜免疫反应,提高了DNA不育疫苗的抗生育率。白细胞介素31、白细胞介素15与草原兔尾鼠DNA不育疫苗pcD-Lzp3滴鼻共免疫小鼠,所产生的抗体水平和抗生育率均低于chi-（pcD-Lzp3+pcD-mIL-33）共免疫组。这些结果说明小鼠细胞因子白细胞介素33与白细胞介素31、白细胞介素15相比较,具有更强的分子佐剂功效。非细胞因子FAI3作为分子佐剂与DNA不育疫苗pcD-Lzp3,通过滴鼻和口服两种黏膜免疫途径共免疫小鼠,不仅增强了体液免疫反应,还激发了机体的粘膜免疫反应。因此,mIL-33和FAI3都可以作为分子佐剂,与DNA不育疫苗pcD-Lzp3共免疫,能够显著提高DNA不育疫苗pcD-Lzp3的抗生育效果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 第一章 卵透明带不育疫苗的研究进展
• 1. 卵透明带（ZP）蛋白不育疫苗
• 2. 卵透明带（ZP）多肽不育疫苗
• 3. 卵透明带（ZP）DNA 不育疫苗
• 4. 结论与展望
• 第二章 免疫不育疫苗的发送系统
• 1. 病毒载体
• 2. 细菌载体
• 3. 菌影
• 4. 植物发送载体
• 5. 其它合成发送载体
• 6. 结论与展望
• 第三章 佐剂增强黏膜免疫效果的研究进展
• 1. 粘膜免疫系统
• 2. 细菌毒素
• 3. 分子佐剂
• 4. 结论与展望
• 参考文献
• 第二部分 研究正文
• 第一章 分子佐剂真核表达载体的构建及其在哺乳动物细胞中的瞬时表达
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 质粒和菌株
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 生化试剂的配制
• 1.5 构建pMD18-T-mIL-15/ fai3/ mIL-31/mIL-33
• 1.6 重组质粒的构建
• 1.7 重组质粒在真核细胞中的瞬时表达
• 2 结果
• 2.1 小鼠IL-15、IL-31 和IL-33 基因以及FAI3 基因的扩增
• 2.2 重组质粒的构建
• 2.3 重组质粒在真核细胞中的瞬时表达
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第二章 细胞因子IL-31 通过滴鼻途径增强草原兔尾鼠卵透明带3 DNA 疫苗抗生育效果的研究
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 质粒和菌株
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 生化试剂的配制
• 1.5 LZP3 融合蛋白的表达与纯化
• 1.6 Chitosan-DNA 复合物的制备及检测
• 1.7 Chitosan-DNA 复合物的扫描电子显微镜检测
• 1.8 免疫ICR 小鼠
• 1.9 LZP3 特异性抗体的检测
• 1.10 MTT 法检测淋巴细胞增殖
• 1.11 小鼠生育实验与合笼
• 1.12 卵巢组织学分析
• 1.13 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 LZP3 融合蛋白的表达与纯化
• 2.2 重组质粒pcD-Lzp3 和pcD-muIL-31、pcD-mIL-31 的大量制备及鉴定
• 2.3 Chitosan-DNA 复合物的理化性质及抵抗DNase I 消化的检测
• 2.4 滴鼻免疫后血清中IgG 抗体水平的检测
• 2.5 血清中IgG1、IgG2a 抗体分型的检测
• 2.6 生育小鼠和不育小鼠血清中的IgG 抗体水平相关性分析
• 2.7 肺洗液、生殖道洗液和粪便中sIgA 抗体水平检测
• 2.8 细胞免疫反应的检测
• 2.9 小鼠的生育率
• 2.10 卵巢组织形态学检测
• 讨论
• 参考文献
• 第三章 细胞因子IL-33、IL-15 通过滴鼻途径增强草原兔尾鼠卵透明带3DNA 疫苗抗生育效果的研究
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 质粒和菌株
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 生化试剂的配制
• 1.5 LZP3 融合蛋白的表达与纯化
• 1.6 Chitosan-DNA 复合物的制备及检测
• 1.7 免疫ICR 小鼠
• 1.8 LZP3 特异性抗体的检测
• 1.9 MTT 法检测淋巴细胞增殖
• 1.10 小鼠生育实验与合笼
• 1.11 卵巢组织学分析
• 1.12 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 滴鼻免疫后血清中IgG 抗体水平的检测
• 2.2 血清中IgG1、IgG2a 抗体分型的检测
• 2.3 生育小鼠和不育小鼠血清中的IgG 抗体水平相关性分析
• 2.4 生殖道洗液和粪便中sIgA 抗体水平检测
• 2.5 细胞免疫反应的检测
• 2.6 小鼠的生育率
• 2.7 卵巢组织形态学检测
• 讨论
• 参考文献
• 第四章 分子佐剂FAI3 通过滴鼻途径增强草原兔尾鼠ZP3DNA 疫苗抗生育效果
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 2.1 重组质粒在真核细胞中的表达
• 2.2 血清特异性IgG 抗体水平的检测
• 2.3 血清中IgG1 、IgG2a 抗体分型的检测
• 2.4 生殖道洗液和粪便中sIgA 抗体水平检测
• 2.5 淋巴细胞增殖反应
• 2.6 小鼠抗生育结果
• 2.7 卵巢组织形态学检测
• 讨论
• 参考文献
• 第五章 分子佐剂通过口服途径增强草原兔尾鼠卵透明带3DNA 疫苗抗生育效果的研究
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 质粒和菌株
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 生化试剂的配制
• 1.5 LZP3 融合蛋白的表达与纯化
• 1.6 Chitosan-DNA 复合物在胃液中的稳定性检测
• 1.7 口服饵料的制备
• 1.8 免疫ICR 小鼠
• 1.9 LZP3 特异性抗体的检测
• 1.10 MTT 法检测淋巴细胞增殖
• 1.11 小鼠生育实验与合笼
• 1.12 卵巢组织学分析
• 1.13 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 Chitosan-DNA 复合物抵抗胃酸消化的检测
• 2.2 口服免疫后ELISA 检测血清中IgG 抗体水平
• 2.3 血清中IgG1 、IgG2a 抗体分型的检测
• 2.4 检测粪便中sIgA 抗体水平
• 2.5 淋巴细胞增殖反应
• 2.6 小鼠的抗生育实验
• 2.7 卵巢组织形态学检测
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 结论与展望
• 附录1: 小鼠IL-15、IL-31 和IL-33 基因以及FAI3 基因序列
• 附录2: 英文缩略语
• 附录3: 主要实验仪器
• 博士及硕士期间已发表和待发表的论文
• 致谢
• 个人简介