小麦抗白粉病相关转录因子TaWRKY34的功能分析

论文摘要

小麦白粉病是影响小麦产量的主要病害之一,在全球范围内都有影响。本研究结合病毒诱导的基因沉默(VIGS)及瞬时表达的方法,对本实验室筛选出的抗白粉病相关转录因子TaWRKY34进行功能研究。研究的意义在于通过这些方法的应用,在当代即获得目标基因的抑制表达和过表达植株并进行初步的功能分析,从而为构建转基因植株打下基础。研究内容如下比对WRKYs蛋白序列得到该基因家族的保守结构域,在此基础上,预测目的基因上siRNA靶序列,构建用于VIGS的重组病毒载体。以小麦抗病近等基因系Pm16/beijing837为材料,通过VIGS的方法,获得TaWRKY34的抑制表达植株和对照后,对这些植株施加小麦白粉病流行小种E09进行胁迫并观察它们的病理表型变化,发现VIGS处理单株上病斑的出现时间普遍较对照组延迟。因而推测TaWRKY34可能对Pm16/beijing837的白粉病抗性起负调控作用。此外,构建TaWRKY34的过表达载体,应用基因枪法转化TaWRKY34在小麦抗病近等基因系Pm16/beijing837叶片中进行瞬时表达,对转化成功的叶片表皮细胞进行白粉病抗性评价,通过观察孢子与宿主细胞的互作形态和孢子穿透率的统计分析得到结果表明TaWRKY34的过表达一定程度上增大了孢子对叶片表皮细胞穿透机率,推测TaWRKY34可能在Pm16/beijing837的白粉病穿透抗性中起负调控作用。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 WRKY转录因子
• 1.1.1 转录因子的定义、结构特点及分类
• 1.1.2 植物WRKY转录因子的结构与分类
• 1.1.3 植物WRKY转录因子的功能概述
• 1.1.4 WRKY转录因子在抗病方面的调控作用
• 1.1.4.1 植物免疫机制概述
• 1.1.4.2 WRKY转录因子在植物抗病功能方面的研究进展
• 1.2 病毒诱导的基因沉默（VIGS）
• 1.2.1 VIGS的原理和作用机制
• 1.2.2 VTGS的研究进展
• 1.3 瞬时表达
• 1.4 小麦白粉病的研究进展
• 1.4.1 植物与病原关系
• 1.4.2 小麦白粉菌的致病机制
• 1.4.3 小麦对白粉病的防御策略
• 1.4.3.1 乳突反应与穿透抗性
• 1.4.3.2 过敏反应与小种专化抗性
• 1.5 实验目的和技术路线
• 1.5.1 实验目的
• 1.5.2 技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 试剂、酶
• 2.1.3 载体、菌株
• 2.1.4 主要仪器与设备
• 2.1.5 培养基和试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 TaWRKY34的生物信息学分析
• 2.2.1.1 小麦WRKY家族的保守序列分析
• 2.2.1.2 预测TaWRKY34上的siRNA靶序列
• 2.2.2 VIGS分析Ta WRKY34抗白粉病相关功能
• 2.2.2.1 白粉菌小种E09的繁育
• 2.2.2.2 BSMV-TaWRKY34的载体构建
• 2.2.2.3 材料的种植
• 2.2.2.4 接种病毒
• 2.2.2.5 处理材料总RNA的提取
• 2.2.2.6 TaWRKY34的表达量分析
• 2.2.2.7 白粉病胁迫后植株的病理表型观察
• 2.2.3 瞬时表达法分析TaWRKY34抗白粉病功能
• 2.2.3.1 白粉菌小种E09的繁育
• 2.2.3.2 瞬时表达载体构建
• 2.2.3.3 基因枪法转化TaWRKY34在小麦叶片中瞬时表达
• 2.2.3.4 白粉菌接种小麦叶片
• 2.2.3.5 显微镜下观察叶片与孢子的互作形态
• 2.2.3.6 孢子穿透率的统计分析
• 3 结果和分析
• 3.1 TaWRKY34的生物信息学分析
• 3.1.1 TaWRKY34的家族的保守序列分析
• 3.1.2 预测TaWRKY34上的siRNA靶序列
• 3.2 VIGS鉴定TaWRKY34抗白粉病功能
• 3.2.1 白粉病小种E09的繁育
• 3.2.2 BSMV-TaWRKY34的载体构建
• 3.2.3 材料的种植
• 3.2.4 接种病毒
• 3.2.5 处理材料总RNA的提取及反转录
• 3.2.6 病毒外壳蛋白的检测
• 3.2.7 TaWRKY34的表达量分析
• 3.2.8 白粉病胁迫后植株的病理表型变化
• 3.3 瞬时表达法分析TaWRKY34抗白粉病功能
• 3.3.1 白粉菌小种E09的繁育
• 3.3.2 瞬时表达载体构建
• 3.3.3 基因枪法转化TaWRKY34载小麦叶片中瞬时表达
• 3.3.4 白粉病侵染小麦叶片
• 3.3.5 显微镜下观察叶片与孢子的互作形态
• 3.3.6 孢子穿透率的统计分析
• 4 总结
• 4.1 讨论
• 4.1.1 VIGS的应用
• 4.1.2 瞬时表达体系的应用
• 4.2 结论
• 参考文献
• 致谢