论文摘要
本文根据临床表现、家系资料、实验室检查确定了4个血小板无力症先证者的临床表型诊断和分型;应用PCR法对先证者αⅡb和β3基因所有外显子及其侧翼序列进行扩增;产物纯化或T-A克隆后直接测序。突变位点经等位基因特异PCR或直接测序排除基因多态性。采用PCR定点突变的方法构建αⅡb P126H、L721R和Q860X突变真核表达载体,分别与表达β3的真核表达载体共转染293T和CHO细胞。采用流式细胞术检测细胞膜上αⅡbβ3的表达,用Western印迹法鉴定αⅡbP126H、L721R和Q860X突变体在细胞内的总体表达,采用免疫荧光共聚焦显微镜确定αⅡbP126H、L721R和Q860X突变体的细胞内定位。结果显示:对4个先证者进行基因分析发现6种αⅡb基因突变,包括C1750T（R584X）,69-79del,A2334C（Q747P）,T2255G（L721R）,C2671T（Q860X）,C470A（P126H）突变,其中P126H、L721R、Q860X、69-79del为国际首次报道。P126H、L721R突变体转染的细胞表面几乎检测不到αⅡb,Q860X突变体转染的细胞αⅡb表达率明显减低。αⅡbP126H、L721R与B3共表达后,可检测到前体αⅡb,未检测出成熟αⅡb。αⅡbQ860X与B3共表达后,检测到分子量减低的截短型αⅡb蛋白。P126H、L721R和Q860X突变αⅡb蛋白主要分布于内质网,仅有少量进入高尔基体中。三种突变阻碍了pro-αⅡbβ3复合物由内质网向高尔基体的转运,导致细胞内滞留,L721R突变可能对Q860X突变的αⅡbβ3复合物的表达有显性抑制作用,初步阐明了P126H、L721R和Q860X突变导致血小板无力症的分子机制。不同浓度的玉足海参糖胺聚糖（GAG）与人血管内皮细胞株EA.hy926共孵育或相同浓度GAG与EA.hy926细胞孵育不同的时间,检测细胞培养上清中游离组织因子途径抑制物（TFPI）的抗原含量和活性水平:定量测定EA.hy926细胞内TFPI mRNA水平;观察细胞内、表面TFPI荧光强度的变化。采用凝血酶、组织型纤溶酶原激活物（t-PA）、氯化钙建立正常人混合血浆的体外凝块溶解实验,分别加入不同浓度的GAG和/或凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）特异的抑制剂羧基肽酶抑制物（CPI）,观察凝块的凝固和溶解时间,以及TAFI相关的凝块溶解延滞（TRR）时间。结果显示:GAG以浓度和时间依赖的方式促进血管内皮细胞TFPI的合成、表达和分泌;GAG以浓度依赖的方式缩短TRR,抑制TAFI功能促进血栓的溶解。上述研究进一步阐明了GAG抗血栓形成的作用机制。
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标签：血小板无力症论文; 血小板糖蛋白论文; 糖胺聚糖论文; 组织因子途径抑制物论文; 凝血酶激活的纤溶抑制物论文;