猪瘟病毒C-株全长cDNA感染性的恢复及其标记疫苗的构建

论文题目: 猪瘟病毒C-株全长cDNA感染性的恢复及其标记疫苗的构建

论文类型: 博士论文

论文专业: 临床兽医学

作者: 张淼涛

导师: 张彦明,谢庆阁

关键词: 全长,基因重组,体外转录,转染,感染性,猪繁殖与呼吸综合征,标记疫苗

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 猪瘟是危害养猪业的重要疾病之一。猪瘟病毒(CSFV)C-株是世界范围内公认的免疫性能良好的弱毒疫苗株。为探讨CSFV C-株组织毒在SK-6 细胞上的嗜性及其检测方法,以CSFV C-株兔脾组织毒为对象,以SK-6 细胞作为病毒宿主,借助直接荧光抗体染色、夹心ELISA 和RT-PCR 等方法研究了病毒抗原的表达并检测了病毒核酸序列,结果表明,C-株兔脾组织毒可在SK-6 细胞中低水平增殖和表达。ELISA 法和RT-PCR 法适于检测CSFV 弱毒疫苗株,但直接荧光抗体染色法不宜用于CSFV 弱毒疫苗株的检测。该研究为CSFV 弱毒疫苗株的检测提供了一定指导,为C-株兔脾组织毒在SK-6 细胞中的增殖培养奠定了基础,也为CSFV 的逆向遗传学研究提供了基础条件。经过测序发现本研究室前期构建的CSFV 全长cDNA 分子中存在几个致死性突变位点,致使该cDNA 缺乏感染性,为了恢复其感染性,采用RT-PCR、Nested PCR 和Half-nested PCR 技术从实验感染兔脾组织的总RNA 中得到了CSFV C-株全长cDNA 的3 个待改造片段,分别克隆于pMD18-T 载体后进行测序。用重组技术分别从前期构建的5’半长cDNA或3’半长cDNA 中替换F1、F3 和F51,构建成两个新的半长cDNA,进一步连接成新的全长cDNA,经测序证实全长cDNA中3个致死性突变位点均得到改正。借助脂质体转染技术转染SK-6 细胞,检测了CSFV 的抗原表达和特异性核酸序列,结果表明该全长cDNA 具有感染性。成功地建立了CSFV C-株反向遗传操作系统,为从事CSFV 分子生物学研究提供了重要的技术平台。本研究进一步利用该感染性克隆作为骨架,利用猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 基因作为标记基因,通过基因工程技术插入CSFV Npro基因的起始密码子ATG 后,借助脂质体转染SK-6 细胞,检测了包含PRRS 病毒GP5 基因的一段重组序列及CSF 病毒的抗原表达,结果表明GP5 基因在细胞连续传代5 到10 代后仍然稳定的插入在CSFV的序列中,培养细胞中存在猪瘟抗原,由于构建的重组病毒可通过检测GP5 区段的特异序列区别于猪瘟野毒,另外,标记基因为PRRSV 的主要抗原基因,因而该重组体可望作为CSFV C-株活病毒标记疫苗,用于CSF 和PRRS 的免疫预防。

论文目录:

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英文摘要

文献综述

第一章猪瘟及猪瘟病毒的研究进展

1 猪瘟的研究进展

1.1 猪瘟概述

1.2 猪瘟的流行和分布

1.3 猪瘟的临床症状和致病机理

1.4 猪瘟的诊断

1.5 猪瘟的防治

1.6 猪瘟的传统疫苗

2 猪瘟病毒的病原学特征及研究进展

2.1 猪瘟病毒的形态及理化特性

2.2 猪瘟病毒的基因组结构及研究进展

3 猪瘟病毒的增殖及细胞培养

3.1 CSFV 的入侵及增殖

3.2 猪瘟病毒对宿主细胞的致病机理

3.3 猪瘟病毒的细胞培养

第二章瘟病毒蛋白结构和功能的研究进展

1 结构蛋白的结构和功能

1.1 核衣壳蛋白C

1.2 Erns

1.3 囊膜糖蛋白E1

1.4 囊膜糖蛋白E2

2 非结构蛋白的结构和功能

2.1 Npro 蛋白

2.2 p7 蛋白

2.3 NS2-3、NS2 和NS3 蛋白

2.4 NS4A 和NS4B 蛋白

2.5 NS5A 蛋白

2.6 NS5B 蛋白

3 小结和展望

第三章猪瘟标记疫苗的研究进展

1 猪瘟疫苗研究的历史回顾

2 猪瘟标记疫苗研制的意义

3 猪瘟标记疫苗的研究

3.1 猪瘟亚单位标记疫苗的研究

3.1.1 亚单位疫苗的研究

3.1.2 猪瘟E2 亚单位疫苗的研究

3.2 猪瘟重组标记疫苗的研究

第四章动物致病性正链RNA 病毒逆向遗传学研究进展

1 研究动物正链RNA 病毒感染性cDNA 的意义

2 逆向遗传学研究的理想系统及影响cDNA 感染性的因素

2.1 构建感染性cDNA 的理想系统

2.2 影响感染性的因素

2.2.1 非完整基因组与完整基因组的比例

2.2.2 扩增和克隆增殖过程中的突变

2.2.3 基因组5’末端碱基冗余或缺失

2.2.4 基因组3’末端碱基冗余

2.2.5 基因组中帽子结构

3 动物正链RNA 病毒基因组克隆应用概况

3.1 进一步揭示病毒的分子特征

3.2 研究新型疫苗

3.3 开发新的基因工程载体

3.4 研究重构病毒可以代替实验动物模型

4 小结

试验研究

第五章猪瘟病毒C-株兔脾毒在SK-6 细胞中的增殖培养及其鉴定

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 种毒

1.1.2 试剂

1.2 方法

1.2.1 病毒的提取

1.2.2 SK-6 细胞的复苏和培养

1.2.3 细胞接毒和样品采集

1.2.4 病毒的检测

1.2.4.1 毒抗原的直接荧光抗体检测

1.2.4.2 病毒抗原的夹心ELISA 检测

1.2.4.3 病毒RNA 的RT-PCR 检测

2 结果

2.1 直接荧光抗体染色结果

2.2 病毒抗原的夹心ELISA 检测结果

2.3 病毒RNA 的RT-PCR 检测结果

3 讨论

第六章猪瘟病毒C-株(脾淋毒)全长CDNA 分子几个突变位点的重组改造

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待改造CSFV C-株(脾淋毒)

1.1.2 试剂与引物

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 及3 个待替换cDNA 片段的亚克隆

1.2.2 全长cDNA 的改造

1.2.2.1 5’半长cDNA 中F1 片段的替换改造

1.2.2.2 5’半长(NF1)中F3 片段的替换改造

1.2.2.3 3’半长cDNA 中F51 片段的替换改造

1.2.2.4 全长cDNA 的重新连接

1.2.3 感染性的初步鉴定

1.2.3.1 模板DNA 的线性化

1.2.3.2 体外转录及纯化处理

1.2.3.3 转录产物的电泳鉴定

1.2.3.4 转染SK-6 细胞

1.2.3.5 病毒抗原和核酸序列的鉴定

2 结果

2.1 cDNA 合成及PCR

2.2 PCR 产物的克隆及序列测定

2.3 全长cDNA 的改造及鉴定

2.3.1 5’半长cDNA 和3’半长cDNA 的改造

2.3.2 全长cDNA 的重新连接和鉴定

2.4 感染性的鉴定

2.4.1 病毒抗原的夹心ELISA 检测结果

2.4.2 病毒RNA 的RT-PCR 检测结果

3 讨论

第七章猪瘟病毒C-株重组标记疫苗的构建

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 重组质粒

1.1.2 试剂与引物

1.2 方法

1.2.1 GP5 基因的插入和pGEM-5zf(+)/NFL/GP5 克隆的构建

1.2.1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 基因的PCR 扩增

1.2.1.2 F11 和F12 的PCR 扩增

1.2.1.3 pMD-18T/F1/GP5 重组质粒的构建及其阳性克隆的鉴定

1.2.1.4 pGEM-5zf(+)/N5’/GP5 重组质粒的构建及其鉴定

1.2.1.5 pGEM-5zf(+)/NFL/GP5 的构建及其鉴定

1.2.2 重组病毒复制及病毒抗原的检测

1.2.2.1 重组病毒核酸序列的RT-PCR 检测

1.2.2.2 重组病毒猪瘟抗原的夹心ELISA 检测

2 结果

2.1 GP5 基因的插入和全长pGEM-5zf(+)/NFL/GP5 克隆的构建

2.1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 基因的PCR 扩增

2.1.2 F11 和F12 的PCR 扩增

2.1.3 pMD-18T/F1/GP5 重组质粒的构建及其阳性克隆的鉴定

2.1.4 pGEM-5zf(+)/N5’/GP5 重组质粒的构建及其鉴定

2.1.5 pGEM-5zf(+)/NFL/GP5 的构建及其鉴定

2.2 重组病毒复制及病毒抗原的检测

2.2.1 重组病毒核酸序列的RT-PCR 检测

2.2.2 重组病毒猪瘟抗原的夹心ELISA 检测

3 讨论

结论

参考文献

作者简介

致谢

发布时间: 2005-12-22

参考文献

[1].猪瘟病毒C株重组标记疫苗候选株免疫原性与鉴别检测[D]. 廖迅.浙江大学2016

猪瘟病毒C-株全长cDNA感染性的恢复及其标记疫苗的构建

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