论文摘要
骨是成年人体中少数几个仍保持再生潜能的器官之一，是唯一一个生命中能保持不断重塑的器官。骨有两种形成方式即膜内成骨和软骨内成骨。骨再生与软骨内成骨相似，主要始于间充质干细胞的趋化和增殖。有效的骨再生在临床上许多骨或肌肉骨骼系统疾病中发挥着非常重要的作用，如部分骨缺损、骨折不愈合，骨质疏松性骨折，失败的脊椎融合术等。因此，探究阐明骨形成的分子机制对于了解骨疾病的发病机理至关重要。在胚胎成骨以及成人骨修复和骨转换中涉及到一类被广泛应用的细胞—间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs），传统认为MSCs主要存在于骨髓，但是后期研究发现MSCs也可以存在其他组织器官。MSCs具有多向分化潜能，能分别向成骨、成脂、成软骨、成纤维等细胞系分化。有许多研究显示有许多不同的信号通路在调控干细胞自我更新及世系提交等方面发挥着重要的作用，但是在骨再生研究中调控间充质干细胞向成骨方向分化的机制是需要关注且探讨的关键性问题。骨形态发生蛋白（Bone Morphorgenetic Proteins，BMPs）对于发育过程中的细胞增殖和分化都发挥着重要的作用，可以调控间充质干细胞向骨、软骨、脂肪和肌腱等方向分化，是研究比较早，也是最具有潜力的一类诱导MSCs成骨分化的细胞因子。BMPs属于TGF-β超家族成员，目前已知有20余种BMPs。本实验室前期对BMP2-BMP15共14种BMPs进行了系统分析，发现BMP9是诱导间充质干细胞在体内和体外成骨分化能力最强的BMPs成员。BMP9（也称为生长分化因子2, GDF-2）最初是从生长发育的小鼠肝脏中分离得到的，它的作用包括：诱导和维持前脑胆碱能神经元的表型，抑制肝脏葡萄糖产生，诱导脂代谢关键酶表达及刺激小鼠铁调素1的表达。BMP9诱导成骨的活性具有潜在的临床应用价值，也越来越受到关注，但是BMP9在诱导干细胞成骨过程中的调节机制却不甚明了。许多其他生长因子可能与BMP9诱导成骨存在协同或拮抗作用，本实验室也已经进一步证实了BMP9调节着一系列特异的下游靶通路，这些通路的因子都在BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化过程中发挥着重要作用。本实验研究的目的是：探究（1）Notch信号通路是否与BMP9在诱导间充质干细胞成骨分化中存在着必然的联系；（2）Notch信号通路在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中发挥着关键且不可缺的作用；（3）BMP9调控Notch信号通路诱导间充质干细胞成骨分化的可能机制。在本研究的第一部分：首先，使用Notch信号传导通路中的关键酶γ-分泌酶的抑制剂Compound E抑制了γ-分泌酶的活性，通过检测早期成骨指标碱性磷酸酶（ALP）活性，研究其对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化作用的影响，结果表明：抑制γ-分泌酶的活性可以降低BMP9诱导iMEFs细胞的早期成骨作用。随后，通过茜素红S染色分析成骨晚期指标钙盐沉积的情况，结果显示抑制γ-分泌酶的活性可以降低BMP9诱导的iMEFs细胞的晚期成骨作用。此部分初步证实，Notch信号通路在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中发挥着重要的作用，为后续研究奠定基础。接下来，提取iMEFs总RNA，通过RT-PCR检测Notch受体和配体的内源性表达情况，结果表明Notch1表达最多，而Notch4，DLL3及DLL4则看不到表达。因此，我们想看看表达最多的Notch1对BMP9诱导iMEFs细胞成骨分化的影响，提取显性负性Notch1（dnNotch1）腺病毒感染过的iMEFs的总RNA，进行RT-PCR证实dnNotch1的竞争性抑制作用，为接下来的体内和体外实验保证抑制Notch1活性奠定基础。体外实验，通过ALP定性和定量实验，免疫细胞化学检测OPN和OCN表达以及茜素红S染色实验结果表明，dnNotch1可以抑制BMP9诱导间充质干细胞早期成骨指标ALP的活性，抑制晚期成骨指标OPN和OCN的表达以及抑制钙盐沉积，并且其抑制作用存在剂量依赖性。体内实验，将腺病毒dnNotch1和BMP9共同感染iMEFs，在裸鼠皮下进行注射，检测dnNotch1竞争性抑制Notch1后，对BMP9诱导的间充质干细胞的体内成骨作用的影响，结果表明：（1）细胞接种4周后，各组都形成了坚硬的包块，表明各组均有骨组织形成。（2）Micro-CT扫描和影像重建结果显示抑制Notch1作用可降低形成的骨包块的体积。（3）石蜡包埋、切片进行HE染色，结果显示dnNotch1能够抑制骨小梁数量及形成质量。（4）Alcian Blue染色结果显示dnNotch1能导致不成熟的软骨基质形成。（5）Masson’s Trichrome染色结果显示dnNotch1导致蓝绿色的骨基质明显减少，骨组织成熟度降低。总之，抑制Notch1的活性，能够降低BMP9诱导的间充质干细胞体内成骨分化的数量以及成熟质量，这与之前的体外实验结果亦相吻合。通过前面两个方面的研究，可知道Notch与BMP9在诱导间充质干细胞成骨分化方面存在着密切的联系。然后，又引入使用两个配体Jagged1和DLL1过表达腺病毒，通过提取腺病毒Jagged1或DLL1感染过的iMEFs细胞的总RNA，进行RT-PCR验证Jagged1及DLL1过表达的效果，为后续实验打基础。在体外实验中，用Jagged1或DLL1与BMP9联合感染iMEFs后，通过ALP定性和定量实验检测早期成骨指标ALP活性，免疫细胞化学检测成骨晚期指标OPN和OCN表达以及茜素红S染色检测晚期成骨指标钙盐沉积，结果显示DLL1能够在体外增强BMP9诱导iMEFs成骨分化的作用，Jagged1能在体外增强BMP9诱导的ALP活性，钙盐沉积及OPN的表达。体内实验，将Jagged1或DLL1和BMP9共感染iMEFs细胞，对裸鼠进行皮下注射，4周后观察并获取皮下包块，Micro-CT扫描和影像重建，石蜡包埋，切片，进行组织化学染色（HE染色，Alcian Blue染色和Masson’s Trichrome染色），结果显示， DLL1能增加BMP9诱导的iMEFs成骨分化活跃程度，与体内实验结果相一致，而Jagged1则能增加软骨形成，降低骨成熟度。总之， DLL1过表达能够增强BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化，而Jagged1则降低骨成熟度。进一步，想最终确认Notch信号通路与BMP9的密切联系，引入使用两个特殊的小鼠成纤维干细胞株DKO-PS1：PS1（γ-分泌酶关键成分）及PS2双敲除后，外源性植入PS1进行补救，相当于正常细胞株；DKO-EV：PS1及PS2双敲除后，外源性植入空载体，做对照，想检测当PS1敲除后，Notch信号传导受阻碍对BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的影响。首先，采用Western Blot检测PS1及nacastin的表达情况，证实PS1确实补救成功。紧接着，通过体外实验检测，BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的早期指标ALP的活性及晚期指标OPN和OCN的表达情况及晚期指标钙盐沉积情况，结果显示PS1敲除相比PS1补救的iMEFs，BMP9诱导成骨分化的作用明显降低。体内实验结果显示，PS1敲除后BMP9诱导的骨形成包块体积明显减小，骨小梁数量及形成质量明显降低，骨包块的成熟程度及骨形成过程的活跃度度亦明显降低。总之，此部分结果表明PS1作为Notch关键酶γ-分泌酶的关键成分在BMP9诱导的iMEFs成骨分化中发挥着关键而不可缺的作用，进一步说明Notch信号通路在BMP9诱导成骨分化中的关键作用。通过第一部分的结果，初步了解到：（1）抑制γ-分泌酶的活性能降低BMP9诱导的iMEFs在体内及体外的成骨作用；（2）dnNotch1竞争与配体结合从而抑制Notch1活性亦能在体内及体外降低BMP9诱导iMEFs的成骨作用；（3）过表达配体DLL1能增加体内及体外BMP9诱导的成骨作用，Jagged1能增加体外BMP9诱导成骨作用，而在体内增加软骨形成，降低骨成熟度；（4）敲除γ-分泌酶关键成分PS1干扰Notch信号传导能明显降低BMP9诱导的iMEFs在体内及体外的成骨作用。总之，可以认识到Notch信号通路在BMP9诱导的成骨分化中发挥着重要不可缺的作用，Notch信号通路是BMP9发挥作用的重要的下游靶通路。因此，在第二部分将初步探讨BMP9调控Notch信号通路的机制：（1）dnNotch1竞争与配体结合抑制Notch1活性，Jagged1或DLL1过表达，敲除γ-分泌酶关键成分PS1，对BMP9诱导iMEFs成骨分化早期细胞增殖及细胞周期的影响；（2）BMP9促进iMEFs成骨分化过程Notch胞内段NICD及Notch1在细胞内表达情况；（3）iMEFs细胞中BMP9诱导iMEFs成骨分化过程中Notch家族受体及配体基因表达情况及PS1敲除后BMP9作用下Runx2、OPN、OCN、Hey1、Id1和CTGF表达变化。首先，流式细胞术检测，作用24h后，dnNotch1能明显降低BMP9促进iMEFs增殖的作用，即G2期及G2+S期明显降低；Jagged1或DLL1则能明显增加BMP9的作用，即G2期及G2+S期明显增高；DKO-PS1相比DKO-EV的G2期及S期+G2期同样明显升高。这部分表明，BMP9在诱导间充质干细胞成骨分化早期具有促进细胞增殖的作用而Notch信号通路在BMP9促进细胞增殖中发挥着必不可少的作用。其次，免疫细胞荧光化学检测，作用24h后，BMP9能明显增加iMEFs细胞中Notch胞内段NICD的表达，并且主要定位于细胞核内，同样BMP9也能增加细胞中Notch1的表达。然后，通过RT-PCR检测BMP9作用下，Notch受体和配体mRNA在iMEFs细胞中的表达情况，从结果看，不同的Notch成员呈现不同的表达趋势。从第1-3天，不同的Notch成员表达变化完全不同。在第1天BMP9明显促进Notch1、Notch2及DLL4的表达，而对Jagged2及DLL1有轻度抑制表达作用，BMP9促进表达的Notch成员多于抑制表达的成员。接着，将PS1敲除后，BMP9作用下，第3天及第5天Runx2、OCN、OPN和Id1明显降低，Id1在PS1补救后第5天比第3天表达降低；第2天， BMP9作用下DKO-PS1的Hey1及CTGF都明显高于DKO-EV。通过第二部分结果，得知：（1）BMP9在诱导间充质干细胞早期能够促进细胞的增殖，在抑制Notch1活性及敲除PS1后，BMP9促进细胞增殖的作用也随之下降，Jagged1及DLL1则能增加这种促进作用。这可能与Notch参与了BMP9早期促进间充质干细胞增殖的作用相关。（2）BMP9能够增加Notch胞内段NICD的表达，并且促进其转移到核内，同时也能增加Notch1的表达，可能由于BMP9促进Notch1等Notch成员的表达，从而激活信号传导，NICD表达增多并解离，继而进入细胞核内促进下游靶基因的转录表达。（3）BMP9作用下，Notch家族成员表达均发生不同变化，第1天BMP9促进表达的Notch成员多于抑制表达的成员，尤其Notch1表达明显增高。PS1缺失情况下，Runx2、OPN、OCN、Hey1、Id1和CTGF表达均降低，说明BMP9可以调控Notch表达发生变化，而BMP9调控靶基因作用又需要有Notch参与。综上所述，抑制Notch信号通路能抑制BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化中；抑制Notch1活性能抑制BMP9诱导的间充质干细胞增殖和成骨分化中；DLL1增加BMP9诱导的间充质干细胞增殖和成骨分化，Jagged1能增加BMP9诱导的间充质干细胞增殖和体外成骨分化；BMP9作用下，Notch受体和配体均发生不同的表达变化，可能是BMP9通过早期作用于Notch1或其它成员导致其表达发生变化，从而激活Notch如Notch1-DLL1信号传导通路，而增加Notch1胞内段NICD的表达，促进下游靶基因的转录表达，从而参与对细胞增殖的调控，进而促进成骨分化。