彩色马蹄莲细菌性软腐病菌的鉴定及其群体感应淬灭的研究

论文摘要

彩色马蹄莲是近几年在国内外推出的中高档花卉,被公认为21世纪的“花卉之星”,但彩色马蹄莲细菌性软腐病发生严重,且没有理想的防治对策,极大阻碍了彩色马蹄莲在各地的发展。本研究从不同品种的彩色马蹄莲病组织中分离到6个菌株,经形态特征与培养性状比较、生理生化测试、16S rDNA序列分析和致病性测定,结果表明6个分离物均为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora）。此外,信号分子检测试验表明,分离菌株可产生并释放出N-酰基-高丝氨酸内酯（AHLs）类信号分子。为了防治该病害,本研究利用信号分子干扰技术,通过群体感应淬灭酶（AttM解脂酶）,降解病原菌的N-酰基-高丝氨酸内酯（AHLs）类信号分子,降低病原菌在马蹄莲上的致病性,从而达到防治该病害的目的。在研究中,我们一方面利用PCR技术扩增土壤根癌农杆菌EHA105中的attM基因,将其克隆到表达载体pUC19上,转化宿主菌DH5α,构建了DH5α/pUCM,用pUC19中的Plac启动子表达attM基因;另一方面利用PCR技术,扩增大肠杆菌JM109中的Plpp强启动子。随后通过重叠PCR,分别将Plpp启动子与水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）JXOⅢ中的hrfl基因和信号分子淬灭基因attM连接,连接于表达载体pUC19,构建工程菌JM109/pPHA,最终利用启动子Plpp分别表达hrfl基因和attM基因。通过烟草过敏性反应,解酯酶AttM对病原菌信号分子降解作用的检测、以及attM基因编码的解酯酶AttM对彩色马蹄莲软腐病菌菌体生长和致病性的测定实验,表明:（1）自A.tumefaciens中获得的attM基因,在Plac启动子下,在大肠杆菌中可以有效地表达并产生AttM（AHL降解酶）,降解病原菌的信号分子;（2）在表达载体pUC19中,Plpp启动子能同时有效表达attM基因和hrfl基因,可以引起烟草过敏性反应,同时降解病原菌的信号分子且对病原菌产生的信号分子的降解能力更强;（3）AttM解酯酶不影响彩色马蹄莲软腐病菌的菌体生长,但可以通过降解AHLs,影响软腐病菌的致病性,在活体和离体条件下可有效地减弱该病原菌的致病性,利用Plpp启动子表达attM基因和hrfl基因,防治效果更加理想,不仅可以有效防治马蹄莲细菌性软腐病,还能促进植物本身生长,为有效防治彩色马蹄莲细菌性软腐病提供了一种新途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 彩色马蹄莲
• 1 彩色马蹄莲的起源与分布
• 2 彩色马蹄莲生态学特点
• 2.1 温度
• 2.2 光照
• 2.3 水分
• 2.4 土壤酸碱度
• 2.5 营养
• 2.6 休眠期
• 2.7 花期
• 3 彩色马蹄莲的经济意义
• 4 彩色马蹄莲的繁殖
• 5 彩色马蹄莲的病虫害
• 6 彩色马蹄莲细菌性软腐病的研究进展
• 6.1 彩色马蹄莲细菌性软腐病的特点及其危害
• 6.2 马蹄莲细菌性软腐病的病原
• 6.3 彩色马蹄莲细菌性软腐病的防治
• 第二章 细菌群体感应系统及其应用
• 1 细菌QS系统
• -细菌感知种内数量的QS系统'>1.1 G^-细菌感知种内数量的QS系统
• +细菌感知种内数量的QS系统'>1.2 G⁺细菌感知种内数量的QS系统
• 1.3 细菌感知种间数量的QS系统
• 2 细菌群体感应的应用
• 2.1 群体感应淬灭酶干扰病原菌QS系统
• 2.2 信号分子类似物干扰病原菌QS系统
• 2.3 利用QS系统中的信号分子来诱发植物的抗性
• 3 总结
• 下篇 研究内容
• 第一章 彩色马蹄莲细菌性软腐病菌的分离鉴定
• 摘要
• Abstract
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株来源
• 1.2 培养基
• 1.3 菌株分离
• 1.4 细菌形态特征观察及生理生化测试
• 1.5 致病性测试
• 1.6 16S rDNA PCR扩增
• 2 结果
• 2.1 病菌的培养性状及形态特征
• 2.2 生理生化测定
• 2.3 彩色马蹄莲软腐病菌分离及致病性测定
• 2.4 16S rDNA PCR扩增及序列测定
• 3 讨论
• 第二章 利用信号分子干扰技术防治彩色马蹄莲细菌性软腐病菌
• 摘要
• Abstract
• lac启动子表达AttM解酯酶防治彩色马蹄莲细菌性软腐病菌'>第一节 利用P_lac启动子表达AttM解酯酶防治彩色马蹄莲细菌性软腐病菌
• 1 材料和方法
• 1.1 供试菌株及来源
• 1.2 培养基与培养条件
• 1.3 分离菌株的自体诱导物检测
• 1.4 pUCM载体的构建
• 1.5 解酯酶AttM对病原菌信号分子降解作用的检测
• 1.6 解酯酶AttM对彩色马蹄莲软腐病菌菌体生长的影响
• 1.7 离体条件下,解酯酶AiiA、AttM对彩色马蹄莲软腐病菌的致病性影响
• 2 结果
• 2.1 分离菌株的AHL活性测定
• 2.2 attM基因的克隆与测序
• 2.3 AttM解酯酶对AHL信号分子的降解作用
• 2.4 解酯酶AttM对彩色马蹄莲软腐病菌菌体生长的影响
• 2.5 AttM解酯酶对彩色马蹄莲软腐病菌致病性的抑制
• 3 讨论
• lpp启动子表达AttM解酯酶防治彩色马蹄莲细菌性软腐病菌'>第二节 利用P_lpp启动子表达AttM解酯酶防治彩色马蹄莲细菌性软腐病菌
• 1 材料和方法
• 1.1 供试菌株及来源
• 1.2 pPH、pPA、pPHA载体的构建
• 1.3 表达载体的功能验证
• 1.4 工程菌JM109/pPHA的构建
• 1.5 工程菌的功能验证
• 2 结果
• 2.1 pPH和pPA载体的构建
• 2.2 表达载体的功能验证
• 2.3 工程菌JM109/pPHA的构建
• 2.4 pPHA的功能验证
• 3 讨论
• 下一步工作设想
• 参考文献
• 附录
• 致谢