论文摘要
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率占全世界癌症死因的第二位。由于胃癌的筛查目前还没有得到普及和重视，同时早期胃癌无明显临床症状或症状不典型，大多数胃癌确诊时已到属中晚期，化疗是其主要的治疗方法。但是肿瘤耐药性的产生致使胃癌对化疗不敏感，最终导致胃癌治疗的失败。目前认为与肿瘤耐药相关的机制包括：ABC转运蛋白的跨膜转运、细胞解毒能力的增强、DNA损伤修复系统失调、凋亡相关通路受阻等。但是在实验和研究中，以这些分子靶点作为药物靶标进行耐药逆转，仍然存在着许多目前难以解决的问题。近年来研究显示一类长度为22个核苷酸的单链非编码微小RNA（microRNA，miRNA）在肿瘤发生发展中发挥着重要的作用。生物信息学方法显示miRNA通过调节不同的靶基因而发挥重要的生物学效应。在肿瘤耐药方面，miRNA能够通过调控不同的靶点而影响肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。microRNA-21（miR-2l）是目前发现的唯一在多种恶性肿瘤中高表达的miRNA，miR-2l有癌基因性质，抑制miR-21的表达可抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡。目前已有研究发现miR-21与胆管细胞癌、乳腺癌、胰腺癌、恶性胶质瘤等恶性肿瘤的耐药相关，但尚无miR-21与胃癌化疗耐药相关的研究。本研究拟在前期研究和文献报道的基础上，进一步观察miR-21与胃癌化疗耐药之间的关系、并探讨其可能作用机制，从而为临床上胃癌化疗耐药的研究提供新的靶点。本研究分三部分。第一部分miR-21与胃癌细胞顺铂化疗敏感性关系的研究目的：研究miR-21与胃癌细胞顺铂敏感性的关系方法：real-time PCR检测胃癌耐顺铂细胞SGC7901/DDP及耐长春新碱细胞SGC7901/VCR和亲本细胞SGC7901miR-21的表达水平；利用脂质体Lipofectamine2000将成熟miR-21的模拟物mimics、阻遏物inhibitors及阴性对照negative controlRNA（NC）转染至SGC7901和SGC7901/DDP细胞；real-time PCR技术验证转染结果；MTT法检测细胞增殖水平；Annexin Ⅴ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率；PI流式细胞术检测细胞周期。结果：1. miR-21在SGC7901/DDP中高表达，与SGC7901细胞相比，表达增高7.65±1.197倍，差异有统计学意义（P<0.01）；在SGC7901/VCR与SGC7901细胞之间未检测出miR-21表达的差异。2.转染miR-21mimics后SGC7901细胞对顺铂的敏感性下降， mimics组对顺铂的IC50为1.085±0.0639μg/mL，与单纯脂质体组（0.476±0.014μg/mL）相比有显著性差异（P<0.01），NC组对顺铂的IC50为0.487±0.018μg/mL，与单纯脂质体组相比无差异；转染miR-21inhibitors后SGC7901/DDP细胞对顺铂的敏感性增加， inhibitors组对顺铂的IC50为3.116±0.0.165μg/mL，与单纯脂质体组（5.138±0.075μg/mL）相比有显著性差异（P<0.01），NC组对顺铂的IC50为5.175±0.458μg/mL，与单纯脂质体组相比差异无统计学意义。3. SGC7901细胞转染miR-21mimics，NC及脂质体24h后加入终浓度为0.5μg/mL顺铂培养48h后，mimics组凋亡率明显减少，与NC及脂质体组相比有明显差异（P<0.05）；SGC7901/DDP细胞转染miR-21inhibitor，NC及脂质体24h后加入终浓度为5.0μg/mL顺铂培养48h后，inhibitors组凋亡率明显升高，与NC及脂质体组相比有显著差异（P<0.05）。4. SGC7901转染miR-21mimics，NC及脂质体后继续培养48h，mimics组S期细胞明显增多达（42.04%）与NC组相比有明显差异（P<0.05）。结论：miR-21在胃癌耐顺铂细胞株中高表达，转染miR-21mimics后可以导致胃癌细胞SGC7901对顺铂的耐药；转染miR-21inhibitors后可以增加胃癌耐顺铂细胞SGC7901/DDP对顺铂的敏感性，部分逆转顺铂耐药。第二部分miR-21与胃癌细胞阿霉素敏感性关系的研究目的：研究miR-21与胃癌细胞阿霉素化疗敏感性的关系方法：real-time PCR检测经IC50阿霉素、氟尿嘧啶作用72h胃癌细胞SGC7901、MGC803与未经处理相应胃癌细胞miR-21的表达水平；利用脂质体Lipofectamine2000将成熟miR-21的模拟物mimics及阴性对照negative controlRNA（NC）转染至SGC7901和MGC803细胞；real-time PCR技术验证转染结果；MTT检测细胞增殖；Annexin-V FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：1. miR-21在经IC50阿霉素作用72h SGC7901和MGC803中高表达，与未经处理SGC7901及MGC803相比，表达分别增高2.941±0.225倍（P<0.01）、2.164±0.167倍（P<0.01），差异均有统计学意义；经IC50氟尿嘧啶作用72h后胃癌细胞SGC7901和MGC803与未经处理相应胃癌细胞之间miR-21表达无差异。2.SGC7901转染miR-21mimics后①细胞对阿霉素的敏感性下降，mimics组与NC组对阿霉素的IC50分别为0.942±0.027μg/mL、0.335±0.029μg/mL，前者是后者的2.8倍，差异有统计学意义（P<0.01）；②细胞凋亡率明显下降，与NC组相比差异有统计学意义（P<0.05）。3. MGC803转染miR-21mimics后对阿霉素的敏感性下降，mimics组与NC组IC50分别为1.430±0.124μg/mL、0.481±0.034μg/mL，前者是后者的3.0倍，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：经IC50阿霉素处理72h后胃癌细胞miR-21表达增加，转染miR-21mimics后，可以增加胃癌细胞对阿霉素的耐药性。第三部分miR-21对胃癌细胞化疗敏感性影响的机制研究目的：研究miR-21对胃癌细胞化疗敏感性影响的机制方法：RT-PCR及real-time PCR检测SGC7901/DDP与SGC7901细胞间PTENmRNA表达差异，Western-blot法检测SGC7901/DDP与SGC7901细胞间PTEN蛋白表达差异；Western-blot法检测细胞转染miR-21mimics及inhibitors后PTEN、p-Akt、Akt蛋白的表达，MTT法检测细胞转染miR-21mimics联合PI3K通路阻滞剂LY294002对胃癌细胞增殖的影响。结果：1. SGC7901/DDP PTEN mRNA及PTEN蛋白的表达较亲本细胞SGC7901明显减低。2. SGC7901细胞转染miR-21mimics后PTEN mRNA表达明显降低（P<0.01）；转染miR-21mimics后PTEN蛋白在miR-21mimics组表达明显降低，p-Akt/Akt蛋白比值明显增加（P<0.01）。3. SGC7901/DDP细胞转染miR-21inhibitor后PTEN mRNA表达明显增加（P<0.01）；PTEN蛋白在miR-21inhibitor组表达明显增加，p-Akt/Akt蛋白比值明显降低。4. SGC7901转染miR-21mimics后，对顺铂的IC50为1.097±0.031μg/mL，而miR-21mimics联合LY294002组对顺铂的IC50为0.428±0.015μg/mL，差异有统计学意义（P<0.01），提示LY294002可抑制miR-21所导致的胃癌细胞耐药。结论： SGC7901/DDP PTEN mRNA、PTEN蛋白表达均减少；miR-21诱导SGC7901/DDP细胞对顺铂的耐药与PTEN蛋白的表达下调、Akt通路的激活有关；LY294002可抑制miR-21所导致的胃癌细胞耐药。