青岛文昌鱼体液补体介导弧菌溶菌活性及弧菌逃避补体攻击机制的研究

论文摘要

补体的系统发育进化是当今免疫学研究热点之一。比较免疫学研究表明脊椎动物和无脊椎动物补体系统有着共同的祖先。在过去10年里,在无脊椎动物后口类、甚至原口类中,结构和功能相似的一些重要补体组分如C3和B因子已经得到了鉴定,但有关这些动物补体功能的研究相当有限。文昌鱼（Amphioxus）是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型,是研究脊椎动物进化的珍贵材料。本文选择了在系统演化上占据重要地位的文昌鱼,对其体液补体介导弧菌溶菌活性进行研究,并对弧菌逃避补体攻击机制进行探讨。本文首次将测定脊椎动物血清补体溶菌活性的标准方法运用到文昌鱼体液免疫研究中,对文昌鱼体液补体的溶菌活性进行研究。通过文昌鱼体液与弧菌相作用,文昌鱼体液能够在体外抑制溶藻胶弧菌HW284（Vibrio alginolyticus HW284）、副溶血弧菌HW458（Vibrio parahaemolyticus HW458）、哈维氏弧菌SF-1（Vibrio harvey SF-1）的生长,存活率分别为42%, 28%和59%。这样的数据在无脊椎动物的后口类尚属首次。扫描电镜观察表明正常文昌鱼体液存在溶菌活性,例如,能溶解溶藻胶弧菌HW284,而经灭活的体液及无菌过滤海水处理的溶藻胶弧菌HW284表面光滑,细胞完整。用热灭活的兔抗人C3血清处理文昌鱼体液后,再与溶藻胶弧菌HW284相作用,体液溶菌活性明显降低,而经免疫前的兔血清或PBS处理的体液,溶菌活性不受影响,此外,体液经热处理（45℃, 30 min）和反复冻融处理后,文昌鱼体液抑制溶藻胶弧菌HW284生长的活性明显降低,其存活率分别为89%和81%,而正常体液（对照组）作用后,弧菌的生长不受影响。这些结果表明补体作用可能是抑制弧菌生长的主要因素。40 mM EGTA （包含4 mM MgCl2）处理的文昌鱼体液没有影响溶菌活性,与正常体液（对照组）相比,具有相似的溶菌活性,其存活率分别为42%和44% ,在EGTA处理组中添加10 mM CaCl2,没有增强体液的溶菌活性,相反,用40 mM EDTA处理文昌鱼体液,体液的溶菌活性消失,其存活率为86%,在EDTA处理中添加4 mM MgCl2,恢复了体液的溶菌活性,这些实验结果表明文昌鱼体液补体介导的溶菌活性依赖Mg2+,而不依赖Ca2+。另外,用补体替代途径的选择性激活剂—酵母聚糖A处理后的文昌鱼体液,再与溶藻胶弧菌HW284相作用,体液溶菌活性明显降低,与未处理的体液相比,在2倍稀释的体液中,其存活率分别为82%和43%,这些实验结果强烈暗示着补体替代途径的激活与文昌鱼体液的溶菌活性相关。值得注意的是,7种弧菌中,其中4种弧菌—河弧菌HW293（Vibrio furnissi HW293）、辛辛那提弧菌HW287（Vibrio cincinnatiensis HW287）、鳗弧菌W-1（Vibrio anguillarum W-1）和哈维氏弧菌Z3G2（Vibrio harveyi Z3G2）能够抵制文昌鱼体液补体介导的溶菌作用。本文首次将脊椎动物血清补体消耗标准测定方法运用到文昌鱼溶菌功能研究中,使用蛋白酶K消化法分别提取辛辛那提弧菌HW287和溶藻胶弧菌HW284的LPS,经12% SDS-PAGE电泳、银染色后,发现辛辛那提弧菌HW287 LPS既有高分子量的O-抗原又有低分子量的O-抗原的梯状带结构,而溶藻胶弧菌HW284几乎没有高分子量的O-抗原带。高分子量的O-抗原缺乏是与溶藻胶弧菌HW284对文昌鱼体液敏感相一致的。而辛辛那提弧菌HW287具有许多高分子量的O-抗原呈现出补体抵制,表明O-抗原的大小与体液抵制之间是正相关的。此外,用辛辛那提弧菌HW287或溶藻胶弧菌HW284处理后的文昌鱼体液,然后与兔红细胞相作用,结果表明2种弧菌对补体都有消耗,但是与辛辛那提弧菌HW287相比,溶藻胶弧菌HW284对补体消耗显著高的水平。所有这些结果都表明高分子量的O-抗原似乎具有双重的作用:它既能够避免激活补体,又能够阻止结合到细菌表面上的补体损伤细菌细胞膜。由此保护了包括辛辛那提弧菌HW287在内的对文昌鱼体液的杀伤产生抵制作用的弧菌。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 引言
• 1.1 哺乳动物的补体系统研究进展
• 1.2 鱼类的补体系统研究进展
• 1.2.1 硬骨鱼类补体系统的激活途径
• 1.2.2 硬骨鱼类补体系统的特性与功能
• 1.2.3 软骨鱼类补体系统研究概况
• 1.3 无脊椎动物补体系统研究进展
• 1.4 补体系统的系统发育和进化
• 1.5 细菌逃避补体识别和攻击机制的研究进展
• 1.6 问题的提出（研究的目的和意义）
• 第二章 青岛文昌鱼体液补体介导弧菌溶菌活性的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验仪器和试剂
• 2.2.2 溶液的配制
• 2.2.3 文昌鱼体液的提取
• 2.2.4 兔血清的提取
• 2.2.5 细菌的准备
• 2.2.6 溶菌活性实验
• 2.2.7 扫描电镜观察实验
• 2.2.8 兔抗人C3抗血清对文昌鱼体液溶菌活性的影响
• 2.2.9 加热及反复冻融处理对文昌鱼体液溶菌活性的影响
• 2.2.10 鳌合剂EGTA和EDTA对文昌鱼体液溶菌活性的影响
• 2.2.11 酵母聚糖A对文昌鱼体液溶菌活性的影响
• 2.2.12 数据统计与分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 文昌鱼体液的溶菌活性
• 2.3.2 扫描电镜观察结果
• 2.3.3 兔抗人C3抗血清对文昌鱼体液溶菌活性的影响
• 2.3.4 加热及反复冻融处理对文昌鱼体液溶菌活性的影响
• 2.3.5 鳌合剂EGTA和EDTA对文昌鱼体液溶菌活性的影响
• 2.3.6 酵母聚糖A对文昌鱼体液溶菌活性的影响
• 2.4 讨论
• 第三章 弧菌逃避文昌鱼体液补体攻击机制的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验仪器和试剂
• 3.2.2 溶液的配制
• 3.2.3 文昌鱼体液的采集与分离
• 3.2.4 兔细胞的采集、分离、计数与保存
• 3.2.5 靶细菌的培养
• 3.2.6 LPS 的分离提取
• 3.2.7 LPS 的SDS-PAGE
• 3.2.8 LPS 的银染色
• 3.2.9 补体消耗的测定
• 3.2.10 残余补体溶血活性的检测
• 3.2.11 数据统计与分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 弧菌的LPS 分布图与对体液敏感性的关系
• 3.3.2 弧菌对青岛文昌鱼体液补体的消耗
• 3.4 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 作者简介
• 致谢
• 发表论文