交感神经经β肾上腺素能受体途径调控急性肝损伤的研究

论文摘要

一、背景肝脏大范围手术或肝外伤和严重的细菌或病毒感染以及药物中毒可引起急性肝损伤，造成肝脏功能不全甚至继续进展导致肝功能衰竭而使患者死亡。而目前对于急性肝损伤的救治，临床上的药物治疗效果仍然十分有限，其机制也不十分明确。肝组织内炎症反应的调控可分为体液调控和神经调控两方面。目前对肝脏炎症反应的调控研究主要在体液调控方面，而神经调控研究相对较少。近年来研究表明，刺激交感神经兴奋可使炎症状态下的肝损伤加重，而去除交感神经则可缓解肝损伤，促进肝损伤的恢复。国外及我们前期的研究表明，交感神经可通过分泌去甲肾上腺素激动Kupffer细胞上的α肾上腺素能受体而调控肝脏炎症的进展；Kupffer细胞上同样也分布有β肾上腺素能受体，有研究报道在败血症后期，Kupffer细胞上β肾上腺素能受体表达上升并与炎症调控有关系。但这一调控途径的分子机制至今仍不清楚。因此我们设计了以下实验以探讨交感神经兴奋是否通过β肾上腺素能受体途径来调控急性肝损伤，以及这一作用的分子机制。二、目的本实验研究应用β肾上腺素能受体激动剂和阻滞剂作用于急性肝损伤大鼠，观察其对急性肝损伤大鼠肝功能的影响；并通过在体和离体研究探讨Kupffer细胞在交感神经经β肾上腺素能受体途径调控急性肝损伤中的作用及其机制。三、方法1SD大鼠腹腔内注射ISO（异丙肾上腺素），激动β肾上腺素能受体，模拟交感神经兴奋β肾上腺素能受体，以正常大鼠为阴性对照，应用全自动生化检测仪检测外周血中ALT、AST、Alb、TBil的变化情况，肝脏组织HE染色观察病理学变化，明确ISO是否具有肝脏毒性。2以不同剂量（1、10、100mg/kg）ISO激动β肾上腺素能受体，应用CCl4造成大鼠急性肝损伤，并在不同的损伤时相点（24、48、72、96h）取材，以无β肾上腺素能受体激动的急性肝损伤大鼠为阴性对照，检测外周血中ALT、AST、Alb、TBil的变化，HE染色观察病理学变化，探讨β肾上腺素能受体激动剂对急性肝损伤调控的剂量和时间依赖性。3SD大鼠腹腔内注射PRO（普萘洛尔），阻断β肾上腺素能受体激动，抑制交感神经兴奋，应用CCl4造成大鼠急性肝损伤，以无β肾上腺素能受体阻滞的急性肝损伤大鼠为阴性对照，应用全自动生化检测仪检测外周血中ALT、AST、Alb、TBil的变化情况，HE染色观察病理学变化，探讨阻断β肾上腺素能受体激动对急性肝损伤的影响。4SD大鼠腹腔内先注射氯化钆消除大鼠肝脏内的Kupffer细胞后，再注射ISO，兴奋β肾上腺素能受体，应用CCl4造成大鼠急性肝损伤，以无β肾上腺素能受体激动的急性肝损伤大鼠为阴性对照，应用全自动生化检测仪检测外周血中ALT、AST、Alb、TBil的变化情况，HE染色观察病理学变化，探讨Kupffer细胞在β肾上腺素能交感神经调控急性肝损伤中的作用。5应用肝脏原位灌注、Ⅳ型胶原酶消化、Percoll密度梯度离心和选择性贴壁等方法分离纯化得到Kupffer细胞并进行吞噬实验和ED2细胞免疫染色来鉴定。6Kupffer细胞体外分四组培养：PBS组、LPS组、ISO+LPS组、PRO+ISO+LPS组，使用ELISA检测IL-6的表达、real-time PCR检测TIMP-1mRNA的表达情况，初步探索交感神经经β肾上腺素能受体途径调控急性肝损伤中的机制。四、结果1单纯注射ISO和正常大鼠在各项肝功能指标没有统计学差异（P>0.05），ISO不会造成肝损伤。2大鼠肝损伤程度随着ISO剂量的加大而加重（ALT：对照组336.2±140.5，1mg/kg组603.7±239.7，10mg/kg组838.6±448.5，100mg/kg组1571.5±714.7，P<0.05）；在急性肝损伤后第48h对照组与实验组各项肝功能指标均有统计学差异（ALT：290.8±153.9，636.0±385.2，P<0.05；AST：521.0±296.8，2289.1±1361.5，P<0.05；Alb：28.3±1.3，25.2±1.5，P<0.05；TBil：4.1±1.2，24.8±16.9，P<0.05）。3应用PRO阻滞β肾上腺素能受体兴奋，可有效防止大鼠急性肝损伤加重（ALT：激动组606.0±154.9，阻滞组210.0±176.1，P<0.05）。4在去除了Kupffer细胞的情况下，实验组和对照组相比，肝功能检测指标ALT、AST、TBil均无统计学差异（P>0.05）。5Latex-Beads颗粒吞噬实验提示95%以上的细胞具有吞噬能力，ED2抗体染色提示90%以上的细胞为染色阳性细胞。6ELISA检测各组IL-6的表达：各实验组IL-6的浓度与PBS组相比均有统计学差异（P<0.05）；ISO+LPS组IL-6浓度比LPS组低且具有统计学差异（P<0.05）；PRO+ISO+LPS组IL-6浓度相比ISO+LPS组升高且具有统计学差异（P<0.05）。Real-time PCR检测各组TIMP-1mRNA的表达：各实验组TIMP-1mRNA相对表达量与PBS组相比，均有统计学差异（P<0.05）；ISO+LPS组TIMP-1mRNA相对表达量比LPS组低且具有统计学差异（P<0.05）；PRO+ISO+LPS组TIMP-1mRNA相对表达量相比ISO+LPS组升高且具有统计学差异（P<0.05）。五、结论1应用β肾上腺素能受体激动剂，可加重CCl4所致大鼠急性肝损伤，当阻滞β肾上腺素能受体的激动，可缓解CCl4所致大鼠急性肝损伤。因此，交感神经可经β肾上腺素能受体途径来调控急性肝损伤的进程。2当去除大鼠肝脏Kupffer细胞后，再兴奋β肾上腺素能受体不能加重CCl4所致大鼠急性肝损伤。Kupffer细胞在交感神经调控急性肝损伤过程中起到了媒介的作用。3交感神经激动Kupffer细胞上的β肾上腺素能受体，显著抑制IL-6和TIMP-1的分泌和表达，使其肝保护作用下降，加重CCl4所致大鼠急性肝损伤，从而实现交感神经对急性肝损伤的调控。

论文目录

• 缩略语表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 前言
• 第一章 β肾上腺素能受体激动对急性肝损伤的影响
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 结论
• 第二章 Kupffer细胞在β肾上腺素能受体激动调控急性肝损伤进程中的作用
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 致谢