论文摘要
基于转基因植物外源基因的拷贝数对目标基因的表达水平和遗传稳定性有较大影响的研究基础,检测转入受体的外源基因的拷贝数便成为鉴定转基因植物的首要任务之一。本文利用TaqMan实时定量PCR技术检测转基因早实枳（Poncirus trifoliata L. Raf）外源基因的拷贝数,希望能克服传统Southern杂交费时费力、需要DNA量多等不足。我们以早实枳转拟南芥单性结实基因MAC12.2的T0代26个再生株系为研究材料,利用早实枳内源看家基因脂质转运蛋白（PtLTP）作为内参,同时建立内源基因（PtLTP）和外源插入基因（MAC12.2和NPTII）的标准曲线,通过标准曲线获得外源基因参照于内源基因的相对含量,比较两者含量的多少,最终得到外源基因的拷贝数。结果表明利用TaqMan实时定量PCR技术检测转基因植物外源基因拷贝数是一种高通量并且有效的方法,尤其可以将这种方法用于木本转基因植物的早期大批量快速筛选研究。具体研究结果如下：1.对未转化植株（对照）和PCR检测呈阳性的26株转基因早实枳再生苗进行Southern杂交分析。表明在不同转基因再生苗中外源基因MAC12.2的拷贝数为1-5个。2.利用同源克隆的方法,根据已知甜橙的LTP基因序列,得到了早实枳中相应的PtLTP基因序列作为TaqMan荧光实时定量PCR的内参。3.分别绘制了两个外源基因（MAC12.2和NPTII）和内参PtLTP的标准曲线。利用TaqMan荧光定量PCR法,估算了转基因植株外源基因的拷贝数。比较实时定量PCR检测转基因早实枳两个外源基因MAC12.2和NPTII的结果,在26个测试样品中,4个样品（P3、P13、P22、P23）发生了重组,比例为15.4%。4.对利用TaqMan实时定量PCR技术检测转基因植物拷贝数的准确性和可行性进行进一步分析。首先,与传统的Southern杂交法相比,TaqMan法和Southern杂交之间的相关系数达92.21%,只有两个样品（P20和P22）的结果不太吻合。其次,被测试的26个样品中,估算结果大部分都非常接近整数并且重复样品之间的拷贝数变异度很小,在0.07-0.12之间。显然,其结果符合真值。此外,通过两个参数“P”和“SS”的计算结果表明,TaqMan方法的可行性和准确性都较高；P在1.3%～22.5%之间,SS为0.004～0.058。