论文摘要
一、组蛋白去甲基化酶Jhd2、JMJD5的结构生物学研究在真核细胞中,核小体是染色质的基本组成单位,其核心由组蛋白八聚体和缠绕1.75圈的DNA组成。组蛋白尾巴可发生多种翻译后修饰过程,包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化、ADP-核糖基化等。其中甲基化修饰在基因转录调节、异染色质形成、基因组完整性的维持及细胞发育等过程中起重要作用。组蛋白的甲基化发生在赖氨酸的ε-氨基或者精氨酸的胍基上,其中以组蛋白H3和H4上赖氨酸的甲基化最为常见,如H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79、H4K20等。这些位置的赖氨酸残基可发生一甲基化、二甲基化和三甲基化修饰。原来认为甲基化是一种稳定修饰,去甲基化酶的发现说明该修饰是可逆的过程。Jhd2（酿酒酵母）、JMJD5（人）都属于一类包含Jumonji结构域的组蛋白去甲基化酶,它们都以特征性的JmjC结构域为酶活性中心,催化组蛋白的去甲基化修饰。这类去甲基化酶发挥酶活性时需要二价铁离子（Fe2+）和α-酮戊二酸的参与,两者的催化机理很相似,但是它们具有不同的底物选择性:Jhd2可特异性催化底物H3K4me3/me2的去甲基化,JMJD5可特异性催化底物H3K36me2的去甲基化。因此,对Jhd2、JMJD5的结构探索,有助于理解此类酶的催化机制。本论文对Jhd2、JMJD5进行基因的分子克隆、蛋白表达、纯化及结晶条件筛选,目前仍未获得蛋白质晶体。对JMJD5进行三维结构预测,并将JMJD5和已有结构的同源蛋白质进行多序列比对,推测决定底物甲基化状态选择性的关键氨基酸残基。二、金黄色葡萄球菌HssS、HssR的克隆表达纯化与晶体筛选金黄色葡萄球菌是对全球人类健康造成威胁的重要致病菌之一,其侵染人体并导致包括皮肤和软组织感染、心内膜炎、败血症等多种疾病。宿主体内的铁元素是金黄色葡萄球菌侵染过程中重要的营养需求之一,而金属离子是多种生物化学过程如酶催化反应中必须的辅因子。铁元素在脊椎动物细胞中主要以亚铁血红素的形式存在,后者又是血红蛋白和肌红蛋白的重要组成部分。但是当金黄色葡萄球菌摄入高浓度的血红素后,会对自身产生毒害作用,因为亚铁离子被氧化成高铁离子的同时产生超氧阴离子自由基,后者会破坏细胞膜甚至杀死细胞。研究发现金黄色葡萄球菌中由HssS、HssR组成的二组分系统通过感受高浓度血红素的信号可调控分泌系统HrtAB的表达,后者可将细胞内多余的血红素分泌到胞外,从而增强金黄色葡萄球菌对高浓度血红素毒性的耐受能力。HssS是典型的组氨酸激酶,当其感受血红素分子刺激时,第249位组氨酸发生自磷酸化,并将磷酸基团转移到效应蛋白HssR上,活化的HssR作用于HrtAB启动子区的正向重复序列并促进其表达。对HssS和HssR及其复合物进行结构生物学上的研究,有助于解释血红素识别及信号传导的分子机制。已对HssS的胞内片段和HssR的全长进行基因的分子克隆、蛋白表达、纯化及结晶条件筛选的尝试,同时也通过GST-Pull Down实验验证了两者的相互作用,并做了复合物结晶条件的筛选。
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