论文摘要
目的:使用不同剂量氨基葡萄糖（glucosamine,GS）干预实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）大鼠,观察血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的功能及基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）、MMP-9表达的变化,考察不同剂量GS对EAE的治疗效果,研究MMP-2、MMP-9与BBB的相互关系及其在EAE中的作用,探讨EAE的发生、发展机制及应用GS治疗EAE的作用机制,寻求多发性硬化（multiple sclerosis,MS）的有效治疗途径。方法:制备EAE动物模型,用不同剂量GS（90mg/（kg·d）和180mg/（kg·d））治疗EAE,按照通用的五分法评估EAE组、GS1组、GS2组和佐剂组的临床症状,观察发病率、平均起始发病时间、平均高峰期评分、体重变化,并于p.i.6、8、10、12、14、16、18天检测大鼠血清和脑脊液（cerebrospinal fluid,CSF）中白蛋白（albumin, ALB）含量,其CSF与血清ALB比值（albumin quotient,QA）作为评价BBB功能及动态变化的指标。同时取大鼠脑和脊髓制成石蜡切片,行HE染色和MMP-2、MMP-9免疫组化染色。结果:⒈EAE组、GS1组、GS2组p.i.8d前无任何症状,p.i.8～11d开始出现活动减少,食欲减退,体重下降。EAE组于p.i.12d出现临床症状,平均起始发病时间为12.24±0.66天,GS治疗组于p.i.12～14d出现临床症状,平均起始发病时间分别为12.40±0.84天、13.60±1.64天,GS2组与EAE组相比发病时间明显延迟,佐剂组未见发病。p.i.12d EAE组、GS1组、GS2组的发病率分别为62.5%、33.3%和9.0%（n=24）,临床症状评分分别为1.17±1.09、0.54±0.88、0.17±0.57。p.i.14d疾病发展达高峰期,各组临床症状加重,EAE组、GS1组、GS2组的发病率分别为77.8%、44.4%和11.1%（n=18）,临床症状评分分别为2.33±1.57、1.00±1.24、0.33±0.97,此时三组动物体重同p.i.8d相比,平均减轻24.50±8.42g、14.00±7.85g、10.50±5.44g,EAE组较GS治疗组减轻更为明显,而GS2组和GS1组相比差异无统计学意义（P>0.05）。p.i.16～18d多数动物临床症状出现缓解甚至消失,体重逐渐增加。实验中EAE组、GS1组、GS2组平均高峰期评分分别为2.13±1.70、1.08±1.41、0.50±1.02,行秩和检验示:EAE组与GS2组比较差异有统计学意义（P<0.017）,EAE组与GS1组、GS2组与GS1组比较差异无统计学意义（P>0.017）。三组发病率行x2检验示:p.i.12～14d EAE组与GS治疗组、GS2组与GS1组比较差异有统计学意义（P<0.05）,p.i.16d EAE组与GS2组比较差异有统计学意义（P<0.05）。三组临床症状评分行秩和检验示:p.i.12～14d EAE组与GS2组比较差异有统计学意义（P<0.017）,p.i.14d EAE组与GS1组比较差异有统计学意义（P<0.017）,p.i.12～14 GS2组与GS1组比较差异无统计学意义（P>0.017）。⒉EAE组、GS1组、GS2组、佐剂组QA值均出现先升高后下降的变化趋势。EAE组QA值在p.i.6d开始升高,p.i.10d达最大值（0.32±0.10）,明显早于临床症状出现,之后缓慢降低。GS治疗组QA值在p.i.6d仅有少量升高,在p.i.14d达到高峰,同EAE组相比高峰延迟,升高幅度降低。佐剂组QA值在免疫后初期虽有增高,但升高幅度明显低于EAE组。p.i.6～14d EAE组QA值与GS1组、GS2组比较差异有统计学意义（P<0.01）。p.i.8～14dGS1组QA值与GS2组相比差异有统计学意义（P<0.01）。p.i.6～16d EAE组QA值与佐剂组比较差异有统计学意义（P<0.01）。⒊MMP-2和MMP-9在EAE组、GS1组、GS2组、佐剂组中的表达与病理改变和疾病进展相一致。应用图像分析系统测定着色区积分光密度示:EAE组发病早期已有MMP-2、-9阳性表达,早于临床症状出现,p.i.10d MMP-2、-9积分光密度达最大值,之后表达逐渐减低。当MMP-2、-9表达增强时,表现为炎细胞、血管内皮细胞及袖套样结构周围着色加深,其中MMP-9的表达重于MMP-2,且发病急、病情重的大鼠表达更明显。p.i.6～18d EAE组MMP-2、-9表达与QA值比较变化趋势一致,曲线峰值均出现在p.i.10d,即MMP-2、-9表达最强时,QA值也最大,与BBB的动态性变化相符合,二者相关性分析表明呈显著正相关（P<0.05）。GS治疗组p.i.6d MMP-2、-9可有少量表达,p.i.8～12d表达逐渐增强,p.i.12d时积分光密度值达高峰,与EAE组相比表达高峰延迟,阳性染色程度减轻,染色范围缩小。行方差分析示:p.i.6～16d GS治疗组与EAE组MMP-9积分光密度值差异有统计学意义（P<0.01）。p.i.8～14d GS治疗组与EAE组MMP-2积分光密度值比较差异有统计学意义（P<0.01）p.i.8～12d GS2组与GS1组MMP-2、-9积分光密度值相比差异有统计学意义（P<0.01）。结论:1. EAE疾病早期已有BBB的损伤,而且继BBB损伤达高峰后,临床症状开始出现并逐渐加重。2. EAE疾病早期MMP-2、MMP-9表达明显上调,在p.i.10天达最大值,与BBB通透性增高相一致,是参与BBB破坏的重要因素。3. GS使EAE发病率降低,发病延迟,发病高峰症状减轻,表明GS对EAE具有一定程度的治疗作用。4. GS对EAE发病的干预作用与其剂量有关,大剂量GS效果更明显。
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