神经生长因子致哮喘神经源性炎症信号传导通路研究

论文摘要

支气管哮喘是由多种免疫炎症细胞（如肥大细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等）及其细胞组份参与的以反复发作可逆性气流受限和气道高反应性为特征的气道慢性非特异性炎症性疾病。目前认为，神经源性炎症是支气管哮喘发病的重要机制。最近研究发现，以NGF为代表的神经营养因子可能通过促进速激肽释放、诱导气道高反应性和气道重构等多种作用机制参与哮喘的病理生理过程。研究发现变态反应性疾病和哮喘患者，其血清NGF均升高，哮喘患者血清NGF明显较健康对照组高（P＜0.01）；其中变态反应性哮喘患者血清NGF明显高于非变态反应性哮喘患者，而且哮喘程度越严重其血清NGF值越高。NGF与气道高反应性关系密切。有研究报道：给豚鼠静脉注射8ng／kg NGF半小时后可诱发豚鼠气道对组胺的高反应性，气道阻力明显增高，并持续约3小时，用抗NGF抗体则能消除NGF引起的气道功能改变，用神经肽受体-1拮抗剂SR140333也能完全抑制NGF介导的气道高反应性。由此提示NGF引起气道高反应性可能是通过神经肽SP及神经肽A等介导的。神经肽是影响气道功能的强有力炎症因子，它能使气道平滑肌收缩、增强气道的高反应性、促进血管扩张和微血管通透性增加及气道粘膜下腺体分泌增加，使哮喘加重。NGF能诱使气道特异性的感觉神经元表达SP增多。我们以往的研究结果显示正常大鼠腹腔注射NGF后，肺组织中NK-1R表达上调，应用抗NGF抗体可减轻呼吸道合胞病毒（RSV）感染引起的肺组织神经源性炎症，并使肺组织NK-1R表达下调。提示NGF与速激肽的产生有直接关系。近年来，信号传导机制在哮喘发病中的作用越来越成为研究的热点。NGF究竟通过何种信号传导通路上调神经肽SP从而参与哮喘神经源性炎症?目前，绝大部分有关NGF受体和信号传导通路的研究结果都是在神经细胞模型和肿瘤细胞体外研究中得到。而肺和气道的结构和炎症浸润细胞中，上述研究还非常少。最近一项研究发现，予体内NGF干预后，trkA和SP在支配小鼠下呼吸道神经纤维的迷走神经元中的蛋白表达共同增强，提示NGF受体trkA在SP参与启动的神经源性炎症中仍起到重要的介导作用。NGF与trkA结合后，受体出现二聚化，由此导致受体内部酪氨酸的磷酸化，以及随之而来的下游信号传导酶的激活：包括磷脂酶C（PLC-γ），调节蛋白Shc，磷脂酰肌激酶-3（PI3）。通过PLC-γ和Shc的下游信号传导通路激活Ras-有丝分裂原激活蛋白激酶（Ras-MAPK）依赖通路。Ras-MAPK途径是细胞信号传导通路中一条重要途径。Ras-MAPK级联中一般包括Ras／Raf／MAPKK／MAPK／c-fos。Ras属G蛋白，当Ras以GTP结合形式存在时与Raf结合并激活。Raf通过Ras重新回到细胞膜，并被磷酸化和寡酸化。Raf激酶磷酸化MAPK激酶（MAPKK，也称MEK），MAPKK激活MAPK（MAPK也称ERK）。即刻早期原癌基因c-fos是活化MAPK作用的下游分子，活化的MAPK转导入细胞核并激活c-fos和c-jun基因。其产物c-Fos能与c-Jun形成异源二聚体，即活化蛋白-1（AP-1），后者能结合TPA反应元件从而调节与细胞生长、分化有关的基因。表达激活后的MAPK能使一些重要的胞浆蛋白和膜蛋白磷酸化，或者经过MAPK核转位，激活核内转录因子和核蛋白（如c-myc，c-jun，c-fos等），调控基因转录和表达，从而分别从蛋白激酶水平和转录水平介导生物学效应。MAPK还能促进平滑肌增殖、转录因子磷酸化、胞浆蛋白磷酸化及参与激素抵抗型哮喘的发病，可见Ras-MAPK信号转导途径在哮喘发病机制中发挥着及其重要的作用，研究其在NGF所致哮喘神经源性炎症的作用机制有望成为治疗哮喘发病的新靶点。第一部分：神经生长因子调控哮喘大鼠气道神经源性炎症的信号传导通路初探通过鸡卵蛋白（OVA）致敏激发建立哮喘模型，将SD大鼠随机分为3组：哮喘组、正常对照组、抗NGF组，每组12只。模型建立后进行以下研究：取肺组织切片HE染色观察病理改变，以此观察模型的气道炎症程度。取三组大鼠肺组织、背根节采用免疫组化对pan-Ras、pERK、c-fos蛋白进行定位和定性分析。结果显示：在肺组织中pan-Ras、pERK、c-fos阳性反应物质均呈棕黄色，主要位于细胞浆中。哮喘组呈强阳性反应，正常对照组呈弱阳性反应。哮喘组pan-Ras、pERK、c-fos平均灰度值分别为152．65±15.95、152.89±13.52、130.62±10.46较正常对照组（pan-Ras、pERK、c-fos平均灰度值分别为174.74±14.61、179.55±13.83、165.04±11.57）阳性产物的平均灰度值均明显降低（P＜0.01）。抗NGF组大鼠肺组织中免疫反应阳性细胞表达较哮喘组明显减少，呈弱阳性反应（pan-Ras、pERK、c-fos平均灰度值分别为174.08±14.94、177.80±15.08及165.02±11.33）。背根节中pan-Ras、pERK、c-fos阳性反应物质均呈棕黄色，pan-Ras、pERK主要位于细胞浆中，而c-fos位于细胞浆和细胞核中。正常对照组呈弱阳性反应，哮喘组呈强阳性反应，抗NGF组呈弱阳性反应。哮喘组pan-Ras、pERK、c-fos平均灰度值分别为151.40±15.89、154.84±13.22、137.21±113.05较正常对照组171.44±16.43、175.34±13.24、175.51±7.76明显降低，P＜0.01。抗NGF干预后，pan-Ras、pERK、c-fos表达减少，其灰度值分别为168.41±17.27、170.78±13.34及163.89±8.92，较哮喘组有统计学差异，P＜0.05。第二部分：人支气管上皮细胞NGF信号传导通路初探我们选用参与哮喘神经源性炎症的重要效应细胞—正常人支气管气道上皮细胞株（NHBEC）作为研究对象。NHBEC于含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。实验分8组：（1）A组：正常对照组；（2）B组：NGF组；（3）C组：NGF＋PD98059组；（4）D组：PD98059组；（5）E组：NGF＋PMA组；（6）F组：PMA组；（7）G组：NGF＋AG490组（8）H组：AG490组。并分别进行细胞干预。干预后免疫印迹法半定量测定细胞c-fos、p-ERK及total-ERK蛋白含量。RT-PCR方法半定量检测各组细胞NK-1R mRNA含量。并应用免疫细胞化学定性观察各组细胞表达NK-1R的情况。结果显示：与正常对照组相比，c-fos蛋白及磷酸化的ERK1／2蛋白水平在NFG作用30min时，显著增高并达到峰值；而total-ERK蛋白水平则不受NGF影响；在NGF未处理的PD98059组及AG490组c-fos蛋白水平、磷酸化的ERK1／2蛋白水平几乎检测不到；而在NGF组，经NGF作用30min后，可见c-fos蛋白水平及磷酸化的ERK1／2蛋白水平显著增高，c-fos／GAPDH及pERK／GAPDH光密度比值分别为0.8354±0.1012、1.3187±0.2078，与正常对照组相比P＜0.01。PD98059可明显抑制NGF诱导NHBEC表达c-fos蛋白及磷酸化的ERK1／2蛋白，c-fos／GAPDH及pERK／GAPDH光密度比值分别为0.3012±0.1034、0.3146±0.0957，与NGF组相比P＜0.01。PMA可刺激NGF诱导NHBEC表达c-fos及磷酸化的ERK1／2蛋白。而STAT3传导途径特异性抑制剂AG490则无此作用。免疫细胞化学研究结果显示：正常对照组及PD98059组NK-1R表达呈阴性反应；NGF组及NGF＋PMA组呈强阳性反应；PMA组呈阳性反应；而NGF＋PD98059组呈弱阳性反应。RT-PCR结果显示：与正常对照组相比，NK-1RmRNA在NGF未处理的PD98059组表达较少；而在NGF组，经NGF作用1h后，可见NK-1RmRNA水平显著增高（光密度比值1.0682±0.1597），与正常对照组（光密度比值0.3753±0.0642）相比P＜0.01。PD98059可抑制NGF诱导NHBEC表达NK-1RmRNA（光密度比值0.4787±0.0981）。PMA可刺激NGF诱导NHBEC表达NK-1RmRNA。第三部分：c-fos RNAi技术对NGF Ras-MAPK信号通路的影响培养NHBEC，设计c-fos siRNA，通过阳离子脂质体转染至细胞内，再进行NGF干预。实验分（1）A组：正常对照组；（2）B组：NGF组；（3）C组：NGF＋dsRNAnonspecific组；（4）D组：NGF＋FOS1组；（5）E组：NGF＋FOS2组；（6）F组：NGF＋FOS3组；（7）G组：NGF＋空白载体组。细胞干预后分别提取总蛋白免疫印迹半定量测定各组c-fos蛋白表达；提取总RNA RT-PCR半定量检测NK-1R mRNA，并应用免疫细胞化学法定性检测各组NK-1R表达。结果显示：经NGF刺激后，c-fos蛋白表达较正常对照组明显增加，c-fos／GAPDH吸光度比值为1.1861＋0.1427，较正常对照组（吸光度比值0.3122＋0.0914），P＜0.01；c-fos shRNA可抑制NGF诱导NHBEC表达c-fos蛋白，c-fos／GAPDH吸光度比值分别为1.0965±0.2591、0.6574±0.1373、0.3773±0.136；与NGF组比较，P＜0.01；无关shRNA，空质粒均无此作用。与正常对照组相比，NHBEC经NGF作用1h后，可见NK-1RmRNA水平显著增高，NK-1RmRNA／beta-actin吸光度比值为1.0047±0.1106，与对照组（NK-1RmRNA／beta-actin吸光度比值为0.4131±0.0473）比较，P＜0.01。FOS3可抑制NGF诱导NHBEC表达NK-1R mRNA，其NK-1RmRNA／beta-actin吸光度比值为0.6214±0.0971与NGF组相比P＜0.01。无关shRNA，空质粒均无此作用。免疫细胞化学结果显示NK-1R阳性产物为棕黄色，以NHBEC胞浆着色为主。正常对照组NK-1R表达呈阴性反应；NGF组及NGF＋HK siRNA组呈强阳性反应；NGF＋无关siRNA组呈阳性反应；而NGF＋siRNA组呈弱阳性反应。上述三个部分研究提示NGF通过调控神经源性炎症介质SP参与哮喘神经源性炎症机制，其信号通路可能是Ras-MAPK途径。阻断Ras-MAPK信号传导通路，有望成为治疗哮喘的新途径。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、论文正文
• 前言
• 第一章 神经生长因子调控哮喘大鼠气道神经源性炎症的信号传导通路初探
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 结论
• 附图
• 第二章 人支气管上皮细胞NGF信号传导通路初探
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 第三章 c-fos RNAi技术对NGF Ras-MAPK信号通路的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 四、参考文献
• 五、综述 神经生长因子与哮喘神经源性炎症
• 1. 哮喘神经源性炎症
• 2. 神经生长因子的分子结构及蛋白质结构
• 3. 神经生长因子受体及信号传导通路
• 3.1 神经生长因子高亲和力受体及信号传导通路
• 3.2 神经生长因子低亲和力受体及信号传导通路
• 4. NGF与哮喘
• 4.1 哮喘发作时 NGF升高
• 4.2 NGF与气道的高反应性
• 5. NGF与哮喘神经源性炎症
• 5.1 神经源性炎症与哮喘
• 5.2 NGF与感觉神经
• 5.3 NGF与感觉神经肽
• 6. 展望
• 参考文献
• 六、致谢
• 七、发表论文和研究成果