携带bFGF2基因的腺病毒转染内皮祖细胞用于缺血心肌移植的实验研究

论文摘要

缺血性心脏病是目前发病率和死亡率较高的疾病之一。其传统治疗方法无论是PCI还是CABG,效果都受到很多因素的制约。弥漫性、钙化病变或血管末梢病变,均无法进行完全的血运重建。据报道完全的血运重建在CABG患者所占比例小于37%。然而与未完全血运重建相比,一旦进行了完全的血运重建,患者的5年生存率即会显著提高、心绞痛发生率显著降低。因此,PCI或CABG术后,未达到完全血运重建的患者,仍需要附加其它的治疗措施。近年来分子生物学的迅猛发展使心血管疾病的基因治疗成为可能。缺血性心脏病基因治疗的含义是把生长因子基因导入缺血冠脉或心肌中,使之转录、表达有特定生物功能的生长因子蛋白质,从而促心肌血管新生,改善心肌缺血症状,发挥治疗作用。心肌缺血时,心肌能逐渐建立自身的侧支循环,靠代偿性血管新生,适应局部的缺血缺氧。这种血管新生是由多种生长因子参与的。成纤维细胞生长因子（FGF）是一种作用很强的血管生长因子,它通过促进新生血管的形成,改善局部缺血组织的血运微环境,为受损组织的修复和再生创造条件。FGF分bFGF（碱性）和aFGF（酸性）两种,它们通过相同的受体起作用,有相同的生物学效应。但是,bFGF的促血管新生作用是aFGF的30～100倍,而成为极具临床治疗价值的细胞生长因子。大量动物实验和临床研究证明,FGF可增加缺血性心脏病患者的侧枝循环,因此,通过人为给予外源性FGF（重组蛋白或基因）,增加缺血心肌局部生长因子的浓度,可以刺激血管再生,缓解组织缺血,改善心脏功能。但在某些情况下,如衰老、糖尿病、高胆固醇血症等,不仅内源性FGF合成减少,而且血管内皮细胞功能障碍,对FGF的反应能力也下降。在上述情况下,仅仅给以促血管生长因子,不能有效地改善组织缺血。因此,国外很多学者考虑在给予外源性促血管生长因子的情况下,还应提供大量功能良好的内皮细胞,来补充那些因血管再生而增生、迁移、重构的血管壁内皮细胞。近来研究发现,在人的骨髓、外周血和脐血中存在有内皮细胞的前体细胞-内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）。EPCs能特异性归巢于缺血部位并分化为成熟血管内皮细胞参与血管新生,通过补充高增殖活性的EPCs促进旁路血管新生来代偿缺血部位的血供以达到治疗的目的,称为“supply side”策略。这一发现为缺血性疾病治疗提供了新思路。可将内皮祖细胞作为血管基因转移的自身载体,转染促血管生长基因的内皮祖细胞,通过血管新生与血管发生双重机制,增强心肌缺血部位的血管生长,改善心功能。但是,以内皮祖细胞为载体表达bFGF基因是否能够增强移植细胞功能并进一步促进缺血心肌再血管化尚未见报道。本课题将对携带bFGF2基因的腺病毒载体Ad.bFGF2进行扩增及鉴定,同时诱导培养大鼠骨髓内皮祖细胞,用Ad.bFGF2在体外转染骨髓内皮祖细胞并检测其转染效率、蛋白表达及对内皮祖细胞的促增殖及分化作用,在体外研究的基础上,将转染Ad.bFGF2后的内皮祖细胞移植到大鼠缺血心肌,研究移植细胞的存活,及其对于促进血管生长、增加血流灌注、改善心功能的协同治疗作用。一、碱性成纤维细胞生长因子基因重组腺病毒载体（Ad.bFGF2）的扩增及鉴定（实验一）本研究以携带bFGF2基因的重组腺病毒载体Ad.bFGF2及Ad-GFP为原料,在293细胞中进行四代扩增,对重组腺病毒DNA进行PCR检测及接种COS-7细胞行RT-PCR鉴定,将鉴定好的病毒应用氯化铯梯度离心纯化和TCID50方法测定滴度,并对其使用安全性进行鉴定。研究中筛选扩增完成含有目的基因的重组腺病毒Ad.bFGF2,PCR法证明重组腺病毒中稳定地整合有bFGF2的基因,RT-PCR方法检测出重组腺病毒感染细胞中的bFGF2特异性mRNA,表明这些基因可被有效地转录。在293细胞中筛选、扩增出的第4代高滴度重组腺病毒,TCID50方法测定滴度,得到Ad.bFGF2滴度为1.1×109pfu/ml。经氯化铯密度梯度离心后的滴度达到2.0×1012pfu/ml。制备的重组腺病毒Ad.bFGF2以50的MOI值感染Hela细胞后,观察7天,细胞未出现病态反应,证明其具有良好的使用安全性。二、体外分离大鼠骨髓单核细胞并诱导培养内皮祖细胞（实验二）EPCs在骨髓中的含量很少,因此要获得足量的EPCs,体外细胞培养条件下进行分离、纯化和扩增是十分必要的。本研究通过Ficoll密度梯度离心分离大鼠骨髓单核细胞,差速贴壁后置于纤维连接素包被的培养皿中加入10%FCS的DMEM选择性培养基进行诱导培养内皮祖细胞。用倒置相差显微镜观察培养细胞的生长状态,用CD31、CD34、VRGFR-2、Ⅷ因子免疫组化和BS1-Lectin结合能力鉴定培养细胞类型,流式细胞仪检测培养细胞的纯度,透射电镜观察细胞超微结构和内皮细胞特征性细胞器。结果显示:原代培养7d时形成由内皮祖细胞组成的细胞集落;10d时形成明显克隆,两周左右,细胞生长至80%～90%融合。传代培养后,细胞形态及密度均匀,前3天为相对抑制期,此后呈指数形式快速增殖,10天后达到80%-90%融合,可进行传代。细胞表面抗原免疫组化检测结果表明,CD34、VEGFR-2、Ⅷ因子、CD31相关抗原表达均为阳性,分别为90%,92%,95%和65%,85%的细胞可结合BS1-Lectin。流式细胞仪检测结果显示,BS1-Lectin阳性的细胞占85.5%。透射电镜观察可见内皮细胞最具特征性的细胞器Weibel-Palade小体。培养液NO含量检测,与主动脉内皮细胞相比无明显差异。这表明诱导培养出的梭形贴壁细胞就是分化中的内皮祖细胞三、Ad.bFGF2转染EPCs后bFGF2的表达、分泌及促EPCs增殖及分化作用的研究（实验三）为了解重组腺病毒载体对EPCs的最佳转染倍数,本课题以不同MOI值的腺病毒载体Ad-GFP体外转染EPCs,检测转染效率。然后以最佳转染倍数进行EPCs的体外转染研究。Ad.bFGF2以MOI=50转染EPCs后,RT-PCR检测细胞中bFGF2mRNA的转录水平,以免疫组化染色、Western-blot检测转染Ad.bFGF2后,目的蛋白在细胞内的表达及细胞外的分泌情况:硝酸还原酶法检测细胞培养液中NO水平。用MTT法检测转染Ad.bFGF2后对EPCs的促增殖作用;将转染后的EPCs种植于细胞外基质Matrigel上,观察细胞分化情况。结果显示:随着MOI值逐渐增大,Ad-GFP体外转染EPCs的转染阳性率也逐渐增高。MOI=50时阳性率可达90%以上,MOI再增大,阳性率增高不明显。RT-PCR、免疫组化、Western-blot等方法检测表明:MOI=50时Ad.bFGF2可成功将bFGF2基因转入EPCs中,并有目的蛋白表达与分泌。与对照组相比,Ad.bFGF2转染组的EPCs培养液中NO含量更高。MTT检测显示Ad.bFGF2转染后对EPCs有明显的促增殖作用;转染后的EPCs在细胞外基质（Matrigel Matrix）上生长时,出现分化,细胞相互连接成毛细血管网络样结构,说明Ad.bFGF2转染能在体外条件下诱导EPCs的分化,刺激血管发生。四、转染bFGF2基因的EPCs用于缺血心肌移植的实验研究（实验四）在上述体外研究的基础上,这一部分研究是将转染Ad.bFGF2的EPCs进行体内实验,对细胞移植与促血管生长因子联合治疗的效果进行探讨。取Wistar大鼠60只,随机分为4组,每组15只,结扎左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型,10分钟后进行细胞移植,实验前移植细胞先以PKH-26和BrdU进行双标记:组Ⅰ移植转染Ad.bFGF2的EPCs;组Ⅱ单纯移植EPCs;组Ⅲ注射AD.bFGF2;组Ⅳ注射PBS。手术后7天荧光显微镜观察移植细胞的存活率,免疫组化染色及western-blot检测bFGF蛋白的表达,TUNEL染色观察缺血区心肌细胞凋亡的情况;术后4周抗BrdU及抗Ⅷ因子免疫组化染色评价移植细胞分化、心肌血管再生状况,心脏超声检测评价心脏的大小及收缩、舒张功能研究表明:移植的EPCs在移植区可存活,与其它组比较,组Ⅰ经Ad.bFGF2转染的移植细胞存活数量较多;免疫组化及western-blot检测移植区有明显bFGF蛋白的表达;另TUNEL染色显示缺血区心肌细胞凋亡明显减少。术后4周的BrdU及抗Ⅷ因子免疫组化染色结果显示:移植细胞出现分化,形成血管内皮;转染Ad.bFGF2后的EPCs促血管形成作用明显优于其他各组;心功能得到显著改善。研究结论:本课题研究结果显示:将Ad.bFGF2转染的EPCs移植于心脏缺血梗死区后,移植细胞能长期存活,如同时有bFGF2基因的有效表达,二者可发挥协同作用,显著增加移植细胞成活率和新生血管数目,减少缺血区心肌细胞凋亡,改善左室舒张末容积和收缩、舒张功能。当然,目前无论是基因治疗还是细胞治疗都还有许多缺陷,还存在许多未知的、尚待解决的问题,有待我们更深入探讨。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 论文正文部分
• 2）的扩增及鉴定'>第一部分 碱性成纤维细胞生长因子基因重组腺病毒载体（Ad.bFGF₂）的扩增及鉴定
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第二部分 大鼠骨髓内皮祖细胞分离、培养及鉴定的实验研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 2体外转染内皮祖细胞促内皮祖细胞增殖、分化的实验研究'>第三部分 Ad.bFGF₂体外转染内皮祖细胞促内皮祖细胞增殖、分化的实验研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 2基因的内皮祖细胞用于缺血心肌移植的实验研究'>第四部分 转染bFGF₂基因的内皮祖细胞用于缺血心肌移植的实验研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 附录
• 英文论文1
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• 学位论文评阅及答辩情况表