论文摘要
碳水化合物及其与蛋白质或脂类连接形成的糖化合物广泛地存在于生物体中,在生命活动中具有非常重要的意义。细胞表面的糖化合物不仅在正常细胞的识别、细胞黏附和细胞间信号传导等方面具有重要作用,而且在细胞病变、病原感染等病理过程中起到了关键作用。糖芯片是近年来新起的研究糖和蛋白作用的的生物检测技术,因其具有用量少、通量高、灵敏快速及信息量大等优点,已成为推动糖组学研究的强有力工具。多糖芯片是碳水化合物芯片的研究一个重要领域,构建多糖芯片平台无论是用于糖组学研究还是药物开发都是非常有必要的。利用实验室多年来从事的研究海洋多糖分离和提取鉴定等工作基础,在海洋糖库丰富的多糖基础上开展多糖芯片的研究。我们选择标记化学上最常用的标准荧光素异硫氰酸荧光素（FITC）及其衍生物（胺基荧光素,AF）,具有一样的荧光发色基团,可以使用同一仪器在同一激发发射波长检测。分别使用EDC/NHS介导的胺基荧光素对含有糖醛酸的多糖进行标记；二丁基二月桂酸锡（DBTD）催化的异硫氰酸荧光素多糖羟基标记；针对多糖还原端醛基的还原胺化异硫氰酸荧光素标记；选择了34种多糖,成功对不同类型,不同结构,物理化学性质不同的多糖,分别针对多糖羧基,羟基,还原端醛基成功进行了荧光标记,控制标记率在0.4%～2%。分离纯化标记多糖,经过相应的荧光定量和糖含量定量,使用芯片点样仪器将其点印在硝酸纤维素薄膜芯片上制备成荧光标记多糖芯片,利用硝酸纤维素薄膜的空间网状结构和吸附负电荷等特点来固定多糖,经过为减少非特异性的结合降低杂交背景的清洗步骤,多糖会有部分糖链暴露出来,漂浮在硝酸纤维素薄膜上面,和被各种形式的多糖所覆盖的细胞表面类似,可以和蛋白结合以验证其生物活性,这时多糖上标记的荧光探针就可以作为该多糖经过清洗后在芯片上保留量的指示。测多糖荧光探针就可以获知不同多糖在清洗前后的量的差别,即不同多糖的保留率,为糖与蛋白结合后信号的强度对比提供依据。制备了糖胺聚糖多糖芯片,选择与部分糖胺聚糖糖链相互作用的蛋白CS-56来验证荧光标记多糖芯片的可行性,实验发现,CS-56可以结合硫酸软骨素C,硫酸软骨素D,硫酸软骨素A。同过计算保留率和芯片上显示的信号强度,科学比较了CS-56结合能力大小是,硫酸软骨素C>硫酸软骨素D>硫酸软骨素A,不识别硫酸软骨素B,肝素和硫酸乙酰肝素。综上所述,本文系统的研究了多糖的荧光标记,针对不同多糖,选用不同的荧光标记方法标记了34种不同结构的多糖,将荧光标记多糖成功运用于糖芯片研究,即将这些标记后的多糖点印在硝酸纤维素薄膜上制成多糖芯片,利用其荧光强度变化可以获知多糖在硝酸纤维素薄膜上的保留率,从而解决了多糖点印在芯片上经过洗脱前后无法定量这一难题。选择硫酸软骨素抗体CS-56来进行糖与蛋白结合实验,验证了荧光标记多糖制成糖芯片后从事糖与蛋白作用的可行性,制备30多糖样品高密度芯片,初步筛选出能与结缔组织生长因子（Connective Tissue growth factor）相互作用的多糖。为多糖芯片应用于糖组学研究和糖药物的活性筛选提供了方法学参考。