H2S在SHR大鼠中枢心血管效应的机制研究：活性氧的作用

论文摘要

硫化氢（Hydrogen sulfide, H2S）是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后发现的第三类气体信号分子。尽管H2S在体内有广泛的生理作用,但其中枢的心血管效应及其调节机制还知之甚少。研究显示,H2S可以减少神经元活性氧的生成。活性氧（reactive oxygen species, ROS）是体内一系列具有活性的含氧化合物的总称,NADPH氧化酶在中枢催化活性氧的生成中发挥了主要的作用。ROS在中枢和外周都对心血管系统有重要的影响,中枢ROS可介导交感兴奋所致的心血管效应。基于上述理论,本课题提出中枢H2S可能通过抑制NADPH氧化酶的活性减少活性氧的生成,继而抑制交感兴奋和相应的心血管效应。本课题通过整体功能实验和分子实验等方法,期望对H2S的中枢心血管效应机制作较深入的研究。本实验首先采用免疫组织化学的方法观察白发性高血压大鼠（SHR）和正常血压大鼠（WKY）延髓生成H2S的酶CBS的表达,明确心血管相关核团CBS的表达特征。结果显示,在大鼠延髓头端腹外侧（RVLM）和孤束核（NTS）均有CBS免疫阳性细胞的表达。为测定SHR和WKY大鼠中枢CBS的表达水平,采用免疫印迹实验（Western blot）定量分析CBS在延髓腹外侧和下丘脑室旁核的表达,结果显示,CBS在SHR和WKY大鼠延髓腹外侧和室旁核都有表达,且17周SHR大鼠延髓腹外侧CBS的表达水平低于WKY大鼠（P<0.05）,8周大鼠CBS在两个部位的表达均没有明显差别。上述结果提示,内源性H2S的生成减少可能与自发性高血压的发生相关。为观察CBS在中枢神经系统的细胞分布,采用免疫荧光双标结合激光共聚焦显微镜的方法观察了CBS在]EVLM区神经元和胶质细胞的表达,结果显示：RVLM区神经元有CBS的表达,胶质细胞无CBS的表达,即CBS主要分布在RVLM区神经元上通过侧脑室注射和RVLM区微量注射的方法我们观察了H2S的心血管效应。在SHR大鼠和WKY大鼠,侧脑室注射CBS的激动剂SAM均可引起血压的降低和心率的减慢（P<0.05）,低剂量的H2S供体NaHS （2nmol/10μ1、4nmol/10μI）只在SHR大鼠产生降低血压和减慢心率的心血管效应（P<0.05）,在WKY大鼠无明显作用。而高剂量的NaHS （20nmol/10μ1）则可以引起SHR大鼠血压升高和心率加快。提示低剂量的H2S在SHR大鼠可以产生降低血压和心率的心血管效应。结合形态学的实验结果,提示中枢H2S在SHR和WKY大鼠效应的差异可能与两种动物中枢内源性H2S的浓度差异有关。为了进一步明确H2S所作用的心血管相关核团,我们观察了RVLM区微量注射NaHS的效应,结果显示：SHR大鼠RVLM微量注射NaHS（0.4nmol/0.1μ1）可以引起血压下降（P<0.05）,提示RVLM是H2S产生中枢心血管效应的重要核团,其他脑区相关核团注射NaHS产生的心血管效应可能在RVLM进行整合。为了观察H2S的心血管效应是否通过抑制活性氧的产生引起,我们采用了DHE荧光测定法观察了SHR和WKY大鼠RVLM区活性氧的水平。结果显示：WKY对照组红色荧光细胞较为散在,SHR对照组红色荧光细胞较为密集,而SHR侧脑室注射低剂量NaHS （4nmol/10μ1）组红色荧光细胞较SHR对照组明显减少（P<0.05）。为了进一步验证上述实验结果,我们采用酶标法测定超氧阴离子水平,结果显示,SHR对照组大鼠RVLM区活性氧的水平较WKY大鼠高（P<0.05）,而侧脑室注射低剂量NaHS的SHR大鼠其活性氧水平较SHR对照组减少（P<0.05）。这一结果提示,中枢H2S可以引起SHR大鼠RVLM区ROS水平的减少。为了观察H2S的效应是否通过抑制NADPH氧化酶介导,我们采用酶标法测定了不同组SHR和WKY大鼠RVLM区NADPH氧化酶的活性,结果显示：SHR对照组大鼠NADPH氧化酶的活性比WKY大鼠高（P<0.05）；侧脑室注射NaHS可以抑制NADPH氧化酶的活性（P<0.05）,与NADPH氧化酶抑制剂Apocynin产生的结果相似。上述结果也支持我们的假设,即中枢H2S的心血管效应与活性氧的减少有关。为进一步观察H2S的中枢心血管效应与NADPH氧化酶的关系,我们采用Real-Time PCR和Western-blot方法分别检测了NADPH氧化酶亚单位gp91phox、P47phox mRNA水平和P47phox的蛋白磷酸化水平。结果显示,侧脑室注射低剂量NaHS可以降低延髓腹外侧区P47phox mRNA水平,并且P47phox磷酸化蛋白相对总蛋白的比值降低,gp91phox mRNA水平无明显变化。上述结果提示,H2S可以降低RVLM区P47phox的磷酸化水平,抑制NADPH氧化酶的活性,从而减少活性氧的生成。综上所述,我们的实验结果提示H2S在SHR大鼠的中枢心血管效应可能通过以下途径介导：H2S抑制RVLM区NADPH氧化酶的活性,减少超氧阴离子等活性氧的生成,产生降低血压和心率的心血管效应。内源性H2S的生成减少可能参与了自发性高血压的病理过程。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 1.材料
• 1.1 实验动物及一般处理
• 1.2 主要仪器和设备
• 1.3 主要试剂
• 1.4 常用试剂配制及处理
• 1.5 ROS测定相关试剂
• 2.方法
• 2.1 形态学实验
• 2.2 在体急性实验
• 2.3 大鼠脑组织取材及标本处理
• 2.4 荧光测定脑组织活性氧
• 2.5 酶标法测定脑组织活性氧
• 2.6 实时定量PCR测定NADPH氧化酶亚单位mRNA
• 2.7 免疫印迹法测定CBS、P47phox及P47phox磷酸化蛋白含量
• 3.实验数据统计学处理
• 结果
• 1.CBS在心血管相关中枢的分布特征
• 1.1 SHR和WKY大鼠脑干中CBS的分布
• 1.2 CBS在大鼠脑干定位
• 1.3 SHR和WKY大鼠脑内CBS表达的定量分析
• 2S的中枢心血管效应'>2.H₂S的中枢心血管效应
• 2.1 SHR和WKY大鼠侧脑室内注射NaHS引起的血压变化
• 2.2 SHR大鼠侧脑室内注射SAM引起的血压变化
• 2.3 RVLM区微量注射NaHS引起的血压和心率的变化
• 2S对中枢活性氧水平的影响'>3.H₂S对中枢活性氧水平的影响
• 3.1 DHE荧光观察侧脑室注射NaHS后RVLM区ROS水平的改变
• 3.2 酶标法侧脑室注射NaHS后RVLM区ROS水平的改变
• 2S对NADPH氧化酶活性的影响'>4.中枢H₂S对NADPH氧化酶活性的影响
• 4.1 酶标法测定中枢NaHS对NADPH氧化酶活性的影响
• 4.2 NaHS对NADPH氧化酶亚单位mRNA的影响
• 4.3 NaHS对NADPH氧化酶亚单位P47phox蛋白质磷酸化的影响
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录1:在读期间发表的会议论文
• 附录2:文献综述
• 参考文献
• 致谢