四川康砖茶渥堆过程中真菌种群的鉴定

论文摘要

四川康砖茶从属于四川南路边茶,六大茶类中的黑茶大类。四川南路边茶是一类典型的具有中国特色的茶叶种类,是上千年来藏族同胞的生活必需品,具有厚重的历史内涵和文化底蕴。渥堆是形成四川南路边茶品质的关键性工序。黑茶品质形成机理分两大学术派别,一类认为是由于渥堆过程中高温高湿的湿热作用促进物质的相互转化,代表成果体现在雅安茶厂创建的“加温保湿渥堆”法,另一类则认为是由于渥堆过程中存在的复杂的微生物体系所形成的一个生物酶系统促进物质转化,代表成果体现在普洱茶生产的“微生物接种渥堆”法。渥堆过程中通过适当提高原料嫩度辅以接种微生物降低黑茶氟含量亦见报道。近年来的学术成果则主要偏向微生物作用学说。在渥堆过程中,适应于渥堆环境的微生物大量,并在其生命活动过程中释放的胞外酶催化作用下,使内含物成分发生转化、降解等,从而形成黑茶特殊的品质。四川康砖茶已有上千年的生产历史,但四川康砖茶渥堆过程中的微生物的鉴定鲜见报道,其研究成果亦为传统的菌落形态观察。本文以四川康砖茶渥堆样为材料,按照五点取样法,分别从渥堆样中离堆表5cm、20cm、40cm、80cm处取样,通过感官审评和部分品质成份的测定选择在渥堆过程中品质转化最佳的深度进行微生物的分离纯化。将分离纯化的真菌进行显微制片,用于真菌形态学分类的研究。并将分离纯化的各个菌株进行茶汤耐受性试验、高温耐受性试验、产有机酸试验、液态发酵试验确定四川康砖茶渥堆过程中的优势菌株。将鉴定得出的优势菌株进行进行液态培养,将培养所得菌丝团进行DNA的提取,利用通用引物对真菌基因组DNA的ITS序列进行扩增,将扩增产物送至生物公司进行ITS序列的测定,将测定结果与NCBI核酸数据库进行比对,确定真菌种群分类学地位。通过微生物种群的鉴定及相关生理特性的研究,确定康砖茶渥堆过程中的优势种群,以期为四川康砖茶渥堆过程中品质形成机理研究提供参考。1.康砖茶渥堆过程中各个深度品质转化不一致,,中部40-80厘米深度品质转化较优。此区域茶多酚含量较低,氨基酸和水浸出物含量较高。品质感官表现汤色橙红明亮,香气陈香浓郁。2.四川康砖茶渥堆样中形态学鉴定结果显示存在曲霉属、毛霉属、枝霉属、根霉属四大类真菌的12种真菌。3.优势真菌鉴定显示,各真菌菌种在富含茶汤的固体、液体培养基中生长量均不一致。存在部分产有机酸菌株,且产酸结果不一致。各真菌菌株生物学上限温度低于65℃。初步鉴定出5株优势菌株。查阅各优势菌株资料,分析品质形成机理可能为：黑曲霉产多种胞外酶,从各个角度促进品质转化；塔宾曲霉、炭黑曲霉、米根霉产胞外果胶酶促进果胶转化,丰富水浸出物；米根霉、总状毛霉产胞外蛋白酶促进蛋白分解形成氨基酸。4.ITS序列鉴定结果显示,5株优势真菌菌株分别为：黑曲霉（Aspergillus niger）、塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）、总状毛霉（Mucor rouxianus）、炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius）、米根霉（Rhizopus oryzae）。5.四川康砖茶渥堆样中检出真菌与赵振军普洱茶鉴定结果存在一定差异。考虑可能不同黑茶种类其渥堆样中环境条件不一致,对真菌种群的选择存在一定差异,同时由于真菌种群的不一致,同时对品质转化存在不同的作用,从而导致品质特征的不一致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1、文献综述
• 1.1 黑茶加工微生物
• 1.1.1 茯砖茶
• 1.1.2 普洱茶
• 1.1.3 六堡茶
• 1.2 微生物鉴定方法
• 1.2.1 常规方法
• 1.2.2 PCR-RFLP技术
• 1.2.3 PCR-RAPD技术
• 1.2.4 PCR-AFLP技术
• 1.2.5 PCR-DGGE（PCR-Denatured Gradient Gel Electrophoresis）技术
• 1.2.6 rDNA（ribosomal RNA）基因中的ITS区域的分子标记
• 1.3 选题目的及意义
• 2、材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验仪器、设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 取样
• 2.3.2 待试材料筛选
• 2.3.3 真菌的分离纯化和数量测定
• 2.3.4 真菌的形态学鉴定
• 2.3.5 茶汤耐受性试验
• 2.3.6 液体发酵
• 2.3.7 产有机酸试验
• 2.3.8 真菌液体培养
• 2.3.9 真菌DNA提取
• 2.3.10 PCR反应体系
• 2.3.11 PCR产物测序
• 2.3.12 Blast比对
• 3、结果与分析
• 3.1 待试材料筛选
• 3.1.1 四川康砖茶渥堆过程中不同深度茶样感官审评
• 3.1.2 四川康砖茶渥堆过程中不同深度茶样主要品质成分的变化
• 3.2 真菌种群的混合培养及计数
• 3.3 真菌种群的纯化培养及形态学鉴定
• 3.4 优势真菌种群筛选
• 3.4.1 固体培养真菌菌落直径差异
• 3.4.2 液态培养真菌生物量差异
• 3.4.3 真菌种群产有机酸能力比较
• 3.5 优势真菌种群ITS序列分子鉴定
• 3.5.1 真菌ITS序列PCR反应
• 3.5.2 PCR产物测序
• 3.5.3 Blast比对
• 4、讨论
• 5、结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文