猪戊型肝炎病毒RT-nPCR方法的建立及SHEV-JX株的分离

论文摘要

猪戊型肝炎（Swine Hepatitis E）是由猪戊型肝炎病毒（Swine Hepatitis E Virus, SHEV）引起的一种人畜共患传染病,在猪群中主要呈隐性感染。越来越多的研究表明猪戊型肝炎病毒与人戊型肝炎病毒基因组具有很高的同源性,猪戊型肝炎病毒可直接跨物种感染人,因此,SHEV具有重要的公共卫生意义。为了解江西省猪群中猪戊型肝炎的感染情况及病毒特性,本论文进行以下几方面研究。1.根据GenBank中已登录的SHEV基因组序列,设计2对简并引物,建立了一种快速检测SHEV的RT-nPCR方法,可检出SHEV RNA最低含量为2.5×10－5ng。利用建立的方法,对胆汁中SHEV为阳性猪的肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、腹股沟淋巴结、血液、小肠内容物及粪便进行SHEV检测,发现在以上组织脏器中均存在SHEV。对江西省部分地区送检的270份40-90日龄猪的胆汁进行SHEV检测,检测结果表明SHEV的感染呈季节性变化：每年的第一季度（1、2、3月）与第四季度（10、11、12月）SHEV的感染率最高,第三季度（7、8、9月）SHEV感染率较低,第二季度（4、5、6月）SHEV感染率最低。2.以人肺腺癌细胞（A549）作为SHEV的宿主细胞,从猪胆汁样品中分离得到1株猪戊型肝炎病毒,将该分离株命名为SHEV-JX,并对其在A549细胞中的培养特性进行了初步研究。将胆汁样品以0.22μm滤器过滤后接种于A549细胞,盲传至第3代开始出现细胞病变（CPE）,即细胞折光性增强,并逐渐向两级拉伸、破碎,细胞由致密排列生长状态逐渐变成疏松排列,形成交联网状结构,细胞内形成空泡、脱落的现象。第5-7代CPE最为明显,第8代CPE开始减弱,至第10代细胞恢复正常。以特异性的RT-nPCR方法检测第1-10代细胞中SHEV的复制情况,检测结果表明SHEV-JX株在A549细胞中的增殖仅能维持7代。3.以SHEV-JX株的RNA为模板,根据GenBank中己登录的SHEV基因组序列设计6条简并引物,扩增得到了SHEV-JX株基因组的部分序列。该序列长1629 bp, GenBank登录号为：JN052926,包括SHEV ORF2的部分序列（1551 bp）及3’UTR序列（78 bp）。以DNAstar软件将序列与已登录GenBank的猪戊型肝炎病毒核苷酸序列进行比对并绘制系统进化树,由结果可知SHEV-JX株与其它猪戊型肝炎病毒毒株的同源性为74.1%-93.8%,系统进化树显示SHEV-JX株属猪戊型肝炎病毒基因Ⅳ型。对SHEV 3`UTR进行分析,SHEV 3`UTR由两个茎-环结构组成,其中第二个茎-环结构又可分成两个小的茎-环结构,该二级结构受poly（A）长度影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 1 引言
• 1.1 戊型肝炎研究进展
• 1.1.1 戊型肝炎病毒结构及其理化特性
• 1.1.2 戊型肝炎病毒基因组结构
• 1.1.3 戊型肝炎的流行病学
• 1.1.4 戊型肝炎的临床症状及病理变化
• 1.1.5 戊型肝炎的检测方法
• 1.2 戊型肝炎病毒的体外培养
• 1.2.1 原代细胞
• 1.2.2 二倍体细胞
• 1.2.3 传代细胞
• 1.3 单股正链RNA病毒基因组3’非编码区结构与功能分析
• 1.3.1 3'UTR结构与功能的主要分析方法
• 1.3.2 3'UTR一级结构
• 1.3.3 3'UTR高级结构
• 1.3.4 3'UTR结构与功能分析的问题与前景
• 2 猪戊型肝炎病毒RT-nPCR方法的建立及应用
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品
• 2.1.2 主要生化试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.1.4 常用试剂的配制
• 2.1.5 引物设计与合成
• 2.2 方法
• 2.2.1 RNA的提取
• 2.2.2 RT-nPCR
• 2.2.3 PCR产物纯化
• 2.2.4 PCR产物的测序
• 2.2.5 特异性、敏感性及重复性实验
• 2.2.6 猪戊型肝炎病毒对各组织器官感染情况分析
• 2.2.7 猪戊型肝炎病毒感染的季节变化
• 2.3 结果
• 2.3.1 RT-nPCR检测方法的建立
• 2.3.2 猪戊型肝炎病毒的组织分布
• 2.3.3 猪戊型肝炎病毒感染的季节变化
• 2.4 讨论
• 2.4.1 猪戊型肝炎病毒检测方法的建立
• 2.4.2 猪戊型肝炎病毒的组织分布
• 2.4.3 江西省部分地区猪戊型肝炎的检出率及其感染的季节性变化
• 3 猪戊型肝炎病毒江西株（SHEV-JX）的分离
• 3.1 材料
• 3.1.1 病料
• 3.1.2 细胞株
• 3.1.3 主要生化试剂
• 3.1.4 仪器设备
• 3.1.5 常用试剂的配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 A549细胞的培养
• 3.2.2 接毒
• 3.2.3 观察细胞CPE
• 3.2.4 病毒检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 细胞病变（CPE）
• 3.3.2 RT-nPCR检测
• 3.4 讨论
• 3.4.1 体外培养细胞系的选择
• 3.4.2 SHEV病毒江西分离株（SHEV-JX）细胞培养特性
• 4 猪戊型肝炎病毒江西株部分序列克隆分析及3'UTR生物信息学分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 SHEV江西分离株（SHEV-JX）
• 4.1.2 主要生化试剂
• 4.1.3 仪器设备
• 4.1.4 常用试剂的配制
• 4.1.5 引物设计与合成
• 4.2 方法
• 4.2.1 细胞总RNA的提取
• 4.2.2 RT-nPCR
• 4.2.3 PCR产物纯化
• 4.2.4 基因测序
• 4.2.5 序列拼接及同源性分析
• 4.2.6 3'UTR二级结构分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 SHEV西分离株（SHEV-JX）ORF2部分序列及3'UTR序列
• 4.3.2 3'UTR序列分析
• 4.3.3 poly（A）长度对SHEV 3'UTR级结构的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 序列同源性
• 4.4.2 SHEV-JX株3’UTR结构预测
• 5 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介