猪水疱病病毒衣壳蛋白基因自杀性DNA疫苗研究

论文摘要

猪水疱病（Swine vesicular disease,SVD）是猪的一种烈性传染病,其临床症状与猪口蹄疫难以区别,被世界动物卫生组织（OIE）列为A类传染病。疫苗接种是防制传染性动物疫病的最有效的手段之一,SVD灭活苗曾有效地控制猪水疱病临床症状的发生,但并没有评估它是否能降低野生病毒的传播。目前国内外尚无市售的成品SVD疫苗。从SVD的世界流行状况来看,SVD对我国有一定的威胁。冈此有必要研发一种安全、有效、经济的疫苗作为战略储备。 基于甲病毒复制子的自杀性DNA疫苗是近几年发展起米的一种新型疫苗,它比传统DNA疫苗更加安全有效。用自杀性DNA疫苗免疫是增强DNA疫苗免疫效力和安全性的重要策略之一。 为了研究猪水疱病病毒（SVD virus,SVDV）衣壳蛋白基因自杀性DNA疫苗的免疫原性和保护效力,评价自杀性DNA疫苗从分子水平上防制SVD的潜在应用价值。本研究克隆了SVDV HK’70株衣壳蛋白基因1BCD,并进行了测序。应用生物信息学技术,研究了该基因的特征,预测了衣壳蛋白的B细胞表位。利用基因重组技术,构建了包含SVDV 1BCD基因的重组复制子载体pSCA/IBCD,借助脂质体将纯化的重组质粒转染BHK-21细胞,通过RT-PCR法、间接免疫荧光法（IFA）和酶联免疫吸附试验（ELlSA）检测外源基因在细胞中的表达情况和表达蛋白的活性。为评价重组质粒作为DNA疫苗对实验动物及本动物的免疫效果,通过肌肉注射免疫豚鼠和猪,以MTT法检测其外周血淋巴细胞（PBL）的增殖反应活性,以ELISA检测血清SVDV特异抗体变化,以微量中和试验检测其中和抗体水平,以攻毒保护试验评价其诱导的免疫反应抵抗强毒攻击的能力。 结果表明,SVDV HK’70株农壳蛋白基因长2346nt,编码782aa;各结构蛋白VP2（1B）、VP3（1C）和VP1（1D）之间潜在裂解位点为Gln/Gly;SVDV HK’70株属于第二基因群（Group Ⅱ）。SVDV衣壳蛋白的二级结构较为复杂,含有较多的转角和无规则卷曲等柔性区域以及α-螺旋和β-折叠区段;SVDV农壳蛋白的VP1、VP2和VP3上均有多个区域为B细胞优势抗原表位,其中,VP1蛋白的B细胞表位优势区域比VP2和VP3蛋白的多。重组质粒pSCA/1BCD在BHK-21细胞中可表达具有反应原性的SVDV衣壳蛋白:在豚鼠体内可诱导产生SVDV特异性ELISA抗体、中利抗体和淋巴细胞增值反应,表明pSCA/IBCD在豚鼠体内具有免疫原性;在猪体内可诱导产生SVDV特异性的保护性免疫反应,可使3/6的动物获得保护,使1/6的动物推迟7d发病,使2/6的动物推迟1d发病。本研究结果提示自杀性DNA疫苗可作为防制猪水疱病候选疫苗,但其免疫效果须进一步提高。 本研究将甲病毒复制子载体用于SVDV自杀性DNA疫苗研究,获得了初步成功,为SVDV分子疫苗和诊断试剂的进一步研究提供了试验依据和基础材料,并为开展口蹄疫等其它动物病毒性传染病的新型疫苗研究提供实验模型和新的思路。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景、目的和意义
• 1.2 研究内容与方法
• 第二章 猪水疱病病毒衣壳蛋白基因的克隆与序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 细胞、毒株、工程菌株和质粒
• 2.1.2 引物的设计与合成
• 2.1.3 病毒RNA的提取
• 2.1.4 反转录合成cDNA第一链
• 2.1.5 PCR扩增cDNA
• 2.1.6 cDNA的克隆、鉴定及测序
• 2.1.7 衣壳蛋白基因核苷酸及其推导的氨基酸序列的比较分析
• 2.1.8 系统进化树分析
• 2.2 结果与讨论
• 2.1 SVDV HK'70株衣壳蛋白基因RNA的RT-PCR扩增和cDNA克隆
• 2.2 SVOV HK'70株衣壳蛋白基因序列分析
• 2.3 系统进化树分析
• 第三章 猪水疱病病毒衣壳蛋白的二级结构和抗原表位预测
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 SVDV衣壳蛋白氨基酸序列
• 3.1.2 SVOV衣壳蛋白二级结构预测
• 3.1.3 SVDV衣壳蛋白B细胞抗原表位的预测
• 3.2 结果
• 3.2.1 SVDV VP1蛋白的二级结构和抗原表位
• 3.2.2 SVDV VP2蛋白的二级结构和抗原表位
• 3.2.3 SVDV VP3蛋白的二级结构和抗原表位
• 3.3 讨论
• 第四章 猪水疱病病毒衣壳蛋白基因真核复制子载体的构建和体外表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 细胞、菌株和质粒
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 引物的设计和合成
• 4.1.4 重组真核复制子载体的构建
• 4.1.5 重组质粒的制备和纯化
• 4.1.6 BHK-21细胞的转染
• 4.1.7 RT-PCR法检测转染细胞目的基因的表达
• 4.1.8 间接免疫荧光检测
• 4.1.9 双抗体夹心ELISA检测
• 4.2 结果
• 4.2.1 目的基因的获得
• 4.2.2 真核表达质粒的构建及鉴定
• 4.2.3 重组质粒的序列测定及分析
• 4.2.4 RT-PCR法检测结果
• 4.2.5 间接免疫荧光检测结果
• 4.2.6 双抗体夹心ELISA检测
• 4.3 讨论
• 第五章 猪水疱病病毒衣壳蛋白基因自杀性DNA疫苗对豚鼠的免疫效果研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 细胞、病毒、质粒和实验动物
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 质粒大量提取
• 5.1.4 实验动物免疫
• 5.1.5 SVDV特异抗体的检测
• 5.1.6 血清中和抗体的检测
• 5.1.7 豚鼠淋巴细胞增殖试验
• 5.2 结果
• 5.2.1 SVDV特异抗体的产生
• 5.2.2 血清中和抗体的检测
• 5.2.3 淋巴细胞增殖试验
• 5.3 讨论
• 第六章 猪水疱病病毒衣壳蛋白基因自杀性DNA疫苗对猪的免疫保护试验
• 6.1 材料和方法
• 5.1.1 细胞、病毒、质粒和实验动物
• 6.1.2 主要试剂
• 6.1.3 免疫用质粒的制备
• 6.1.4 实验动物免疫
• 6.1.5 SVDV特异性抗体检测
• 6.1.6 血清中和抗体的检测
• 6.1.7 淋巴细胞增殖试验
• 6.1.8 攻毒保护试验
• 6.2 结果
• 6.2.1 SVDV特异性抗体的检测
• 6.2.2 血清中和抗体的检测
• 6.2.3 淋巴细胞增殖试验
• 6.2.3 攻毒保护试验
• 6.3 讨论
• 第七章 结论
• 第八章 文献综述
• 8.1 猪水疱病研究进展
• 8.1.1 猪水疱病的历史和流行概况
• 8.1.2 猪水疱病的病原学特性
• 8.1.3 发病机理和临床症状
• 8.1.4 猪水疱病的流行病学特性
• 8.1.5 诊断
• 8.1.6 猪水疱病病毒的分子生物学特性
• 8.2 自杀性DNA疫苗
• 8.2.1 甲病毒的特点
• 8.2.2 甲病毒复制子载体的构成和特点
• 8.2.3 自杀性DNA疫苗的优点
• 8.2.4 自杀性DNA疫苗诱导细胞凋亡的机理及其免疫机理
• 8.2.5 自杀性DNA疫苗的初步应用
• 8.2.6 存在的问题和展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历