论文摘要
甲壳动物养殖业是我国重要的出口创汇产业。然而,自1992年白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus, WSSV）病的爆发,给我国乃至世界的水产养殖带来巨大的经济损失。因此,对参与病毒感染和复制的宿主蛋白进行鉴定和功能分析,对预防和控制病毒性疾病有重要的意义。泛素化和SUMO化都需要激活酶E1,结合酶E2和连接酶E3的参与,从而对靶蛋白进行特异性修饰。尽管类泛素SUMO的三维结构和酶促反应过程与泛素非常形似,但两类蛋白修饰的生物学意义却迥然不同。本研究选择对虾泛素结合酶和小龙虾SUMO结合酶,分别研究他们介导的泛素化和SUMO化在病毒感染和复制中的功能,进而阐明甲壳动物与白斑病毒相互作用的分子机理。1.中国明对虾泛素结合酶E2（FcUbc）介导白斑综合征病毒含有RING结构域蛋白的泛素化,并抑制病毒的复制我们从中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）中克隆得到了一个泛素结合酶E2,命名为FcUbc。FcUbc的cDNA全长967bp,其中开放阅读框447bp,编码148个氨基酸,包含一个泛素结合酶E2催化结构域（UBCc）。FcUbc特异性的分布于对虾肝胰腺和小肠中,在受到白斑病毒刺激后,都呈现出上调表达的趋势。在大肠杆菌（Escherichia coli）中重组表达并纯化了FcUbc,用重组蛋白制备的多克隆抗体进行免疫组化分析,结果显示内源FcUbc蛋白定位于肝胰腺的B细胞和小肠的上皮细胞。为了研究其功能,除了重组表达FcUbc外,我们对FcUbc的催化活性位点进行了突变,重组表达了其突变体mFcUbc。利用FcUbc重组蛋白注射对虾,明显降低了染毒对虾的死亡率,并且大大抑制白斑病毒的复制。我们利用体外pull-down实验证实重组FcUbc能够结合病毒的四个含有RING结构域的蛋白（WRD1-4）,后者被报道具有潜在的E3连接酶的功能,而突变体mFcUbc丧失了这样的体外结合能力。更重要的是,体外泛素化实验和果蝇S2细胞系（Drosophila melanogaster Schneider2）上的实验都证实了FcUbc介导了WSSV277和WSSV304的RING结构域的泛素化。在感染WSSV的果蝇S2细胞中,过表达的FcUbc增强了病毒WSSV277和WSSV304蛋白的泛素化。以上结果表明中国明对虾FcUbc介导白斑病毒含RING结构域蛋白的泛素化,并最终抑制病毒的复制。2.克氏原螯虾SUMO结合酶（UBC9）介导白斑综合征病毒极早期蛋白的SUMO化修饰并最终促进病毒复制我们从克氏原螯虾（Procambarus clarkii）中克隆得到了小泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-related modifier, SUMO）和SUMO结合酶UBC9。UBC9cDNA全长912bp,开放阅读框483bp,编码160个氨基酸,含有一个UBCc催化结构域,活性位点是位于93位的保守的半胱氨酸。SUMO cDNA全长960bp,开放阅读框282bp,编码93个氨基酸,含有一个泛素样结构域（UBQ）,其活性位点是位于C末端的双甘氨酸残基。序列比对和进化树分析显示UBC9和SUMO进化上高度保守,小龙虾的UBC9和SUMO与酵母和人类的蛋白表现出极高的相似性。UBC9和SUMO组成型的存在于小龙虾各组织,在白斑病毒刺激后呈现上调表达。我们在大肠杆菌中重组表达并纯化了克氏原螯虾的UBC9、SUMO,突变体mUBC9和rnSUMO,及SUMO的活性形式SUMO-GG。向克氏原螯虾体内注射UBC9或SUMO重组蛋白增强了WSSV的基因复制,而突变体mUBC9和mSUMO则丧失此功能。接下来我们进一步分析了克氏原螯虾SUMO化系统促进白斑病毒复制的分子机理。克氏原螯虾UBC9蛋白体外结合WSSV三种极早期蛋白（IE, WSV051, WSV069和WSV187）,其中只有WSV051能够被宿主UBC9介导发生SUMO化修饰。利用干扰降低小龙虾UBC9或SUMO的表达水平,导致病毒晚期基因表达被抑制,极早期基因表达也受到影响而表达量降低；并且这种抑制作用可以被注射的重组UBC9或SUMO解除,从而使感染的WSSV基因表达恢复正常状态。该研究表明小龙虾SUMO化系统被白斑病毒利用来修饰自身的极早期IE蛋白,这种修饰促进了病毒基因的转录和病毒复制。