抗菌肽基因合成与植物表达载体的构建

论文摘要

抗菌肽是自然界中的广泛存在的生物体先天免疫效应因子，因其具有广谱抗菌、杀菌力强、非特异性杀菌、不易使病原体产生抗性等特点而倍受科学家的关注。本研究主要从事抗菌肽基因的合成与植物表达载体的构建，为将来应用于甘蔗遗传转化做准备。本论文主要的内容有： 1) 设计引物利用PCR技术扩增得到抗菌肽基因片段并将其克隆进载体，测序结果表明PCR扩增得到的产物因存在缺失、倒置、突变、插入等现象而不能在下一步的实验中加以利用； 2) 将适合单子叶植物遗传转化的Ubi启动子连接入克隆载体pUC19并两端测序，证实本室保存的Ubi启动子与GENBANK上发布的序列具有很高的同源性，可以用于植物表达载体构建； 3) 用甘蔗偏爱的密码子设计了分泌型抗菌肽基因MSI-99并在其后设计了Nos终止子，在全基因合成得到该基因后在其前面连接上Ubi启动子，将Ubi—MSI-Nos连接到质粒pCAMBI2301的多克隆位点上构建得到植物表达载体； 4) 进行了甘蔗愈伤组织对甘露糖抗性筛选实验，发现培养基中仅含甘露糖而且浓度为30g／L的条件下愈伤组织仍然有少量增长，建议增加甘露糖的浓度直至愈伤组织不能继续生长，以得到最佳筛选浓度。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1 抗菌肽的特性及在植物基因工程上的应用
• 1.1 抗菌肽的种类及抑菌机理
• 1.2 抗菌肽的抗菌活性
• 1.3 抗菌肽在植物基因工程上的应用
• 1.3.1 植物遗传转化中抗菌肽基因的设计与合成
• 1.3.2 转抗菌肽基因植株的获得
• 1.3.3 分泌型信号肽在抗菌肽植物基因工程上的应用
• 2 甘蔗遗传转化研究进展
• 2.1 遗传转化方法
• 2.1.1 基因枪法
• 2.1.2 电激法
• 2.1.3 农杆菌介导法
• 2.2 甘蔗遗传转化常用启动子和选择标记
• 3 PMI/甘露糖筛选体系在植物基因工程中的应用
• 4 甘蔗宿根矮化病的发生及防治
• 5 本研究的依据及意义
• 第二章 材料和方法
• 1. 主要试剂与仪器
• 1.1 基本试剂及生产厂家
• 1.2 酶和其他试剂
• 1.3 本研究所用的菌株及质粒
• 1.4 主要仪器和厂家
• 1.5 培养基
• 1.6 抗生素
• 2. 实验方法
• 2.1 抗菌肽基因分段合成的设计
• 2.1.1 oecropin AD基因的设计
• 2.1.2 shiva-1基因的设计
• 2.1.3 cecropin AD和shiva-1 PCR反应程序设计
• 2.2 全基因合成的抗菌肽基因的设计
• 2.3 质粒 DNA的提取
• 2.3.1 质粒 DNA的小量提取
• 2.3.2 质粒 DNA的大量提取（SDS法）与纯化
• 2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.5 质粒载体和目的 DNA的酶切反应
• 2.6 载体与基因片段的连接
• 2.7 质粒 DNA的转化、筛选和鉴定
• 2.7.1 质粒的转化
• 2.7.2 重组质粒的筛选、鉴定
• 2.8 植物表达载体的构建
• 2.8.1 Ubi启动子的鉴定
• 2.8.2 质粒pCAMBIA2301的获得
• 2.8.3 植物表达载体pCAM-Ubi-MSI的构建
• 2.9 甘蔗愈伤组织的甘露糖抗性筛选
• 第三章 结果与分析
• 1 抗菌肽基因分段合成
• 2 抗菌肽基因的全基因合成
• 3 植物表达载体的构建
• 3.1 Ubi启动子的鉴定
• 3.2 载体pZMLR-MSI-NOS的构建
• 3.3 pCAM-UBI-MSI-NOS植物表达载体的构建
• 4 ROC16愈伤组织的甘露糖抗性筛选
• 第四章 结论与讨论
• 1 结论
• 2 讨论
• 2.1 基因 PCR分段合成的几个问题
• 2.2 甘露糖对甘蔗愈伤组织生长的影响
• 2.3 下一步要做的工作
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表或录用的论文