长穗偃麦草与小麦体细胞杂种的遗传与基因组研究

论文摘要

体细胞杂交技术能够克服有性杂交不亲和及花期不遇等障碍,可以转移有性杂交所不能转移的性状,从而产生多种多样的通过有性杂交无法实现的作物新类型;可以同时转移胞质基因与核基因编码的性状,在植物育种中具有重要的作用。但是,由于体细胞杂交比较难以获得可育再生植株,进而导致对体细胞杂种后代的遗传及基因组无法进行深入的研究。本实验室成功地获得了小麦与长穗偃麦草的对称与不对称体细胞杂种后代,其中对称体细胞杂交获得了多年生的偏草型体细胞杂种株系及后代（因此称为长穗偃麦草与小麦杂种）。本文对两个长穗偃麦草与小麦偏草型体细胞杂种株系（编号分别为Ⅰ和Ⅱ）及其后代进行了表型、性状、遗传及基因组的分析,具体结果如下:1、体细胞杂种及其后代的表型及细胞遗传学分析小麦与长穗偃麦草的对称融合获得了两个偏草型体细胞杂种Ⅰ型和Ⅱ型,Ⅰ型偏向长穗偃麦草,叶色深绿,叶片较宽,表面粗糙;Ⅱ型叶色浅绿,叶片较窄,柔软。对两个偏草型体细胞杂种后代（R）的R1,R2及R3代根尖进行了染色体数目统计及染色体断片和双着丝粒染色体的观察。分析发现Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅰ-3的平均染色体数目分别为64.3、62.1、65.4,染色体数目集中范围为60-70,分别为80.2%、80.2%、84.3%;Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3的平均染色体数目分别为63.8、65.5、66.2,染色体数目集中范围为60-70,分别为75.4%、82.0%、83.0%。在不同的世代中,只在R1代的细胞中发现有染色体断片或双着丝粒染色体,而R2,R3代的细胞中未发现这些染色体结构变异。这表明体细胞杂种的染色体在随后两代中的遗传基本稳定。以小麦基因组为探针、高冰草基因组为封阻对R2代两个偏草型体细胞杂种的根尖进行了基因组荧光原位杂交（GISH）分析。结果表明,在两个偏草型体细胞杂种株系的染色体上有5-6个小麦的染色体小片段,小麦染色体小片段位于杂种染色体的近看丝粒位置及近端部。由此可见,小麦的遗传物质以染色体小片段的方式渐渗到两个体细胞杂种株系中。2、体细胞杂种基因组分析通过对两个类型的体细胞杂种R2和R3代进行RAPD分析发现,杂种带型偏向长穗偃麦草,同时存在少量小麦的特异片段。核基因组SSR及EST-SSR分析进一步验证了这个结果,这与体细胞杂种的偏草型表型保持一致,表明杂种基因组主要以长穗偃麦草基因组为主,同时伴有少量小麦遗传物质的渐渗。此外,SSR分析发现杂种中大量的双亲位点发生缺失,同时有部分新片段产生,推测是体细胞杂交中双亲基因组的混合、消减与渐渗导致的基因组冲击引起了这种变异。与长穗偃麦草愈伤组织相比,R2代杂种中33.4%的检测位点存在甲基化变化,其中24%的位点发生了甲基化,而9.4%的位点发生了去甲基化,这表明体细胞杂交中的基因组冲击导致了大量的甲基化变化。两个杂种之间的甲基化变化有多态性,在R3代Ⅰ-3和Ⅱ-3之间有高达37.8%的检测位点存在甲基化变化的差异,这可能与两个类型杂种株系之间表型等差异有关。此外,虽然在同一个类型杂种的不同代系之间也存在少量的甲基化变化现象,但明显低于体细胞杂交过程中的甲基化变化,这表明杂种在有性世代中逐渐趋于稳定。利用IRAP和REMAP技术对体细胞杂种进行了逆转录转座子相关的分析,发现R0-R3杂种中存在小麦与长穗偃麦草各自特异的转座子序列。在体细胞杂种的形成过程中,大量的的小麦逆转录转座子发生丢失,而长穗偃麦草的逆转录转座子丢失较少;还有少量的逆转录转座子发生激活。在杂种传代过程中,虽然也有少量的逆转录转座子发生丢失和激活,杂种中的逆转录转座子在连续几代中基本保持稳定。由此可见,体细胞杂交可以引起杂种中逆转录转座子的明显变化,但是这些逆转录转座子在后代中很快就稳定下来。3、体细胞杂种耐盐生理特征分析利用不同浓度NaCl处理长穗偃麦草、小麦,长穗偃麦草和小麦体细胞杂种R3代的幼苗,结果表明,长穗偃麦草具有典型耐盐单子叶植物的特征。亲本小麦属非盐生植物,抗盐能力较弱,当NaCl浓度达150mmol/L时已有盐害影响,浓度超过250mM后全部死亡。长穗偃麦草在NaCl浓度为250mmol/L时盐害现象才比较明显;杂种植株的耐盐性远高于小麦,同时也高于长穗偃麦草。在100mmol/L以上NaCl处理组中,杂种的死亡率远较小麦低,甚至低于长穗偃麦草。生长量及各项生理指标的测定也表明杂种的耐盐性不仅远比其亲本小麦（济南177）高,而且还高于长穗偃麦草,这表明体细胞杂交引起了杂种中盐胁迫应答相关基因表达的变化。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 一、体细胞杂交研究
• 1、融合方式
• 2、融合方法
• 3、体细胞杂种的鉴定方法
• 4、原位杂交分析
• 5、分子生物学标记
• 6、体细胞杂交在植物育种中的研究进展
• 7、杂种染色体行为及遗传规律
• 二 植物盐害和植物耐盐机理研究进展
• 1、盐害对植物的影响
• 2、植物耐盐的机理
• 三、植物基因组的表观遗传变化
• 1、甲基化变化
• 2、逆转录转座子的变化
• 四、植物多倍体形成的基因组变化
• 五.本研究的目的和意义
• 第一部分 体细胞杂种与亲本的生长发育比较
• 1.1 实验材料和方法
• 1.2 实验结果及分析
• 第二部分 体细胞杂种后代的细胞遗传学分析
• 2.1 材料和实验方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 染色体制片及观察
• 2.1.3 DNA的提取
• 2.1.4 GISH分析
• 2.2 结果分析
• 2.2.1 不同世代杂种株系根尖染色体分析
• 2不同株系的GISH比较分析'>2.2.2 杂种R₂不同株系的GISH比较分析
• 2.3 讨论
• 第三部分 体细胞杂种耐盐性状相关生理检测分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 不同NaCl溶液的耐盐试验
• 3.1.2.2 耐盐指数的计算
• 3.1.2.3 生物量（鲜重、干重、相对含水量）的测定
• 3.1.2.4 脯氨酸含量测定
• +、K⁺含量测定'>3.1.2.5 Na⁺、K⁺含量测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 幼苗在不同浓度NaCl中生长情况
• 3.2.2 耐盐系数的测定
• 3.2.3 生物量的变化
• 3.2.4 脯氨酸含量的变化
• 3.2.5 无机离子含量的变化
• 3.3 讨论
• 第四部分 体细胞杂种后代的基因组分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 DNA的提取
• 4.1.2.2 RAPD分析
• 4.1.2.3 基因组SSR及EST-SSR分析
• 4.1.2.4 MSAP分析
• 4.1.2.5 IRAP和REMAP分析
• 4.2 结果分析
• 4.2.1 RAPD分析
• 4.2.2 基因组SSR及EST-SSR分析
• 4.2.2.1 SSR分析
• 4.2.2.2 EST-SSR分析
• 4.2.3 MSAP分析
• 4.2.4 转座子区间分析
• 4.3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 博士期间发表的文章
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 附件