马铃薯晚疫病菌miRNA分析及Dicer基因功能研究

论文摘要

晚疫病是全球范围内普遍发生的马铃薯病害,发病迅速且造成巨大的经济损失。马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）侵染马铃薯的叶片,茎以及块茎,造成植株死亡,块茎腐烂。已报道P. infestans菌株T30-4全基因组大小约240Mb,含有大量转座子和反转录转座子,且变异快。本研究选取两个不同致病力的P. infestans菌株YN-YJ54.1和ⅡA-4,利用Illumina测序技术对P. infestans三个（菌丝,萌发的孢子囊,孢子囊）阶段的小RNA进行基因组水平深度测序,分析了P. infestans miRNA的信息,靶基因功能及与Dicer基因的关系的研究。结果显示,菌株YN-YJ54.1的菌丝含有331个新miRNA,对应的靶基因1449个,保守miRNA 1805个,对应的靶基因15300个；萌发的孢子囊含有29个新miRNA,对应的靶基因71个,保守miRNA1527个,对应的靶基因10892个；未萌发的孢子囊含有275个新miRNA,对应的靶基因180个,保守miRNA 1852个,对应的靶基因16540个；菌株ⅡA-4萌发的孢子囊含有4个新miRNA,对应的靶基因9个,保守miRNA1046个,对应的靶基因9328个。受miRNA潜在调控的靶基因占全部基因的80%,具有广泛的功能。在P. infestans中,85%左右的miRNA与线虫,拟南芥,果蝇,动物等物种里面的miRNA序列同源,说明最原始的miRNA在P. infestans中被大量地保存下来。植物和动物的miRNA完全不同,在进化过程中, miRNA被选择性的保留在植物和动物之中。P. infestans中广泛存在的保守miRNA为这一调节分子的进化提供了崭新的证据。P. infestans有两个编码Dicer蛋白的基因DCL1和DCL2。体外siRNA饲喂试验沉默DCL1基因,菌株表现萌发率下降,同时芽管变短；同时沉默两个Dicer基因,也观察到类似性状。这种突变体性状并没有因为增加另一个Dicer蛋白基因的siRNA而变得严重,说明DCL1对于P. infestans孢子囊的萌发和芽管伸长起关键作用。在动植物中,负责miRNA产生的Dicer一旦功能受损,都会产生明显的表型变化。P. infestans中,DCL1功能受损后的表型变异明显,而DCL2功能受损后没有性状,说明它们可能参与不同类型的双链RNA切割。利用Stem-loop RT-PCR证实,在由siRNA饲喂导致DCL1功能受损后的P. infestans中,miR393和miR-2476的表达量,有所下降；miR-2132和miR-1626的表达量没有明显变化,说明DCL1参与了前两个miRNA的产生,其他两个miRNA的产生途经还不清楚。因此,DCL1对于P. infestans的某些miRNA产生是必需的。本实验证明,siRNA的体外饲喂能够成功地沉默P. infestans的内源基因,说明P. infestans具有完整的RNAi途径。可以预计,当寄主马铃薯能产生足够的打靶病原菌内源基因的siRNA,并被正在侵染的P. infestans吸收,就可以干扰其内源基因的表达。此结果为以后应用RNAi技术防治晚疫病提供依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 一、前言
• （一） 马铃薯生产和晚疫病
• 1. 我国马铃薯生产现状
• 2. 马铃薯晚疫病
• 2.1 马铃薯晚疫病的起源、流行及危害
• 2.2 P.infestans群体结构
• 3. 马铃薯晚疫病防治
• 3.1 马铃薯抗病育种研究
• 3.2 化学防治
• 3.3 生物防治
• 4. P.infestans的侵染循环
• （二） 马铃薯晚疫病菌
• 1. P.infestans分类地位
• 2. P.infestans形态结构
• 3. 卵菌与真菌的区别
• 4. P.infestans生理特征
• 5. P.infestans生殖方式
• （三） P.infestans的基因组测序
• （四） 非编码RNA的调控作用
• （五） 研究内容和意义
• 二、实验材料和方法
• （一） 样品的采集
• （二） P.infestans分离及保存
• 1. 组织分离
• 2. 单孢分离
• 3. 菌种保存
• （三） P.infestans最适生长条件测定
• （四） 不同发育阶段菌体的培养
• （五） P.infestans致病力测定
• 1. 马铃薯植株准备
• 2. 播种及接种
• 3. 统计马铃薯植株叶片发病指数
• （六） P.infestans小RNA深度测序
• 1. 样品收集
• 2. RNA提取及浓度检测
• 3. 小RNA测序流程
• （七） 利用体外siRNA饲喂沉默DCL1和DCL2
• （八） Stem-loop Q-PCR实验
• 三、实验结果
• （一） P.infestans不同生长阶段菌体的收集以及RNA的分离
• （二） 小RNA测序结果
• 1. 序列文库制备和数据分析
• 2. 小RNA在P.infestans染色体上的分布情况
• 3. 预测已知保守的miRNA和新的miRNA
• 4. miRNA和相应靶基因功能的识别
• 5. 调节ABC转运蛋白基因的miRNA
• （三） 孢子囊芽管的萌发和生长需要Dicer1（DCL1）的功能
• 四、讨论
• 参考文献
• 附录1 培养基配方
• 附录2 甲醛变性胶配方
• 附录3 小RNA测序相关试剂,仪器
• 附录4 文中涉及的miRNA序列信息
• 致谢
• 附图