层析法分离凝集素、细胞色素C、肌红蛋白以及应用于含血红素蛋白的相互作用的研究

论文摘要

环节动物S型凝集素在结构和生化性质上都有别于一般的S型凝集素。根据其性质，本研究采用惰性分子筛填料Sepharose CL-6B作为亲和层析介质对蚯蚓S型凝集素进行了纯化。以EDTA-MEPBS（2 mmol／L EDTA，4 mmol／Lβ—巯基乙醇，150 mmol／L NaCl，20 mmol／L磷酸盐pH7.2）作为平衡液和氨水（150mmol／L，pH10.5）作为洗脱液得到的蛋白质经SDS—PAGE、凝血实验及荧光检测等证明了其为蚯蚓S型凝集素。本法一个步骤即可从蚯蚓提取液分离到电泳纯的S型凝集素，比起传统方法来更加快捷高效，优越性明显。此方法的应用将有利于对环节动物S型凝集素的深入研究。本研究利用Q Sepharose XL阴离子交换层析法从猪心分离肌红蛋白和细胞色素C。通过实验，发现在pH7.6-8.5的范围内，细胞色素C可以牢固地结合于Q Sepharose XL阴离子交换柱上，肌红蛋白结合强度较低，而大多数的杂蛋白则基本没有结合。因此，在pH7.9条件下上样，pH7.2洗脱就可以将三者分离。通过SDS-PAGE及蛋白相对含量分析表明，通过这一步，肌红蛋白和细胞色素C的纯度分别为89.7％和93.2％。将所得的两样品，再分别进行Sephadex G-75凝胶层析，得到了电泳纯的肌红蛋白和细胞色素C。最终，得到的肌红蛋白和细胞色素C的产量分别为77.43 mg／kg．和84.56 mg／kg。此实验表明，可以通过QSepharose XL阴离子交换层析从猪心快速分离肌红蛋白和细胞色素C。利用亲和层析法研究人血红蛋白、蚯蚓的血红蛋白、马肌红蛋白和马心细胞色素C彼此间的亲和作用。结果表明蚯蚓血红蛋白、人血红蛋白与其他几种含血红素蛋白质间均存在亲和力，并发现这种亲和力的大小与它们间相似性有一定的关系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 层析技术的发展史
• 1.2 液相层析技术的原理和分类
• 1.2.1 液相层析技术的原理
• 1.2.2 液相层析分类
• 1.2.3 生物大分子分离过程常用的液相层析法的特点与应用
• 1.2.3.1 凝胶层析
• 1.2.3.2 离子交换层析
• 1.2.3.3 亲和层析
• 1.2.3.4 疏水层析
• 1.2.3.5 高效液相层析
• 1.3 层析技术的新发展
• 1.3.1 新的层析介质
• 1.3.1.1 双分散孔填料
• 1.3.1.2 触角型（tentacle）吸附剂
• 1.3.1.3 软胶包裹在硬胶表面（soft gel in a rigid shell）
• 1.3.2 新的层析方法
• 1.3.2.1 置换层析
• 1.3.2.2 超高效液相层析
• 1.3.2.3 光层析
• 1.3.2.4 高速逆流层析技术
• 1.4 凝集素的研究状况
• 1.4.1 凝集素的发现和分类
• 1.4.2 凝集素的生物功能及应用
• 1.4.3 半乳凝素
• 1.5 细胞色素C、肌红蛋白纯化方法的研究进展
• 1.6 本研究的内容、目的和意义
• 第2章 SEPHAROSE CL-6B亲和层析一步纯化蚯蚓半乳凝素
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 材料和仪器
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 蚯蚓半乳凝素粗提
• 2.2.2.2 亲和层析
• 2.2.2.3 SDS-PAGE检测
• 2.2.2.4 凝血实验
• 2.2.2.5 荧光分析检测目标蛋白与乳糖的结合
• 2.3 结果
• 2.3.1 亲和层析结果
• 2.3.2 SDS-PAGE结果
• 2.3.3 凝血实验结果
• 2.3.4 荧光检测样品液蛋白与乳糖结合的结果
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 第3章 Q SEPHAROSE XL离子交换层析从猪心快速分离肌红蛋白和细胞色素C
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 材料与仪器
• 3.2.2 猪心粗提液的制取
• 3.2.3 Q Sepharose XL阴离子交换层析最佳pH值的选择
• 3.2.4 阴离子交换层析和凝胶排阻层析
• 3.2.5 SDS-PAGE
• 3.2.6 计算蛋白质含量
• 3.3 结果
• 3.3.1 利用离子交换层析和凝胶层析分离目标蛋白
• 3.3.2 肌红蛋白和细胞色素C的产量
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 第4章 亲和层析法研究几种血红素蛋白的相互作用
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料和仪器
• 4.2.2 亲和层析柱的制备
• 4.3 亲和层析
• 4.4 结果
• 4.5 讨论
• 第5章 小结与展望
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢