论文摘要
蛇广泛分布于世界各地，种类繁多。自古以来，蛇毒一直是传统中医使用最广泛的中药材之一。因此，对蛇毒中的生物活性成份的研究与开发一直是基础医学和制药工业关注的重要研究领域。中国蛇种丰富，在己发现的200多种蛇种及亚种中，至今只对少数几种粗毒或部分纯化的蛋白组份进行了抗肿瘤作用研究，绝大部分蛇毒抗肿瘤成份还没有被发掘出来。磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）能够在磷脂甘油部分的磷脂酰基（sn-2）位点选择性断裂酯键，生成的产物为溶血磷脂和脂肪酸，这种酶几乎存在于所有蛇的毒液中。由于蛇的种类和生活环境的不同，PLA2在结构和功能上也存在着很大的差异。在蛇毒中存在许多PLA2同工酶，它们之间的氨基酸序列的同源性大于90％，结构也较为相似，但却具有不同的药理生理功能。基于上述背景，本研究以我国南方地区富有的蝮蛇蛇毒为分离样品源，拟建立一种简易、快速分离制备蛇毒蛋白的方法；并对从蝮蛇蛇毒中分离得到的蛇毒蛋白组份进行抗肿瘤活性的筛选与评价，旨在发现新的具有抗肿瘤作用的蛇毒多肽，为蛇毒在抗肿瘤治疗中的应用提供新的药物。本文的主要结果与结论如下：一、建立了一种从蛇毒粗毒中一次性快速分离纯化蛇毒蛋白组份的高效液相色谱层析方法。根据目前所见文献报道，从蛇毒粗毒分离蛋白组份一般都采用二步或三步以上的方法。为了能实现一次性快速从蛇毒粗毒中分离蛋白组份，我们对文献报道的方法进行了改进，采用了大颗粒（粒径300（?））的C18反相硅胶作为高效液相色谱柱的填充料，以乙腈／水（0.1％三氟乙酸）作为洗脱体系，在0～120min内作梯度洗脱。采用该方法一次从蝮蛇粗毒中分离出了16个蛋白组份。二、高效液相色谱分离得到的16个蛋白组份的纯度鉴定利用反相高效液相色谱法分别对从蛇毒粗毒中分离得到的16个蛋白组份进行纯度鉴定。C18反相色谱柱，乙腈／水（0.1％三氟乙酸）为流动相，0～40min梯度洗脱。在上述色谱条件下，一次分离得到的16个蛇毒蛋白组份的蛋白质纯度均达到了95％以上，说明本文所建立的方法对蛇毒蛋白的分离具有快速、高纯度的效果。三、高效液相色谱分离的16个蛇毒蛋白组份的分子量确定分别利用电喷雾电离质谱（ESI-MS）和基质辅助激光解吸附-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对分离得到的16个蛋白组份进行了分子量测定，其中组份1、2、3、4、5、6、8、9、10、12、15和16共12个组份的分子量分别是1234.615、1234.575、7480、7554、13900、14504、13912、13962、13974、24748、23337和22695Da。四、高效液相色谱法分离的蛋白组份的蛋白浓度测定采用Bradford方法分别对16个蛋白组份进行了蛋白浓度的分析，以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白制作标准曲线。16个蛋白组份从No.1～16的蛋白浓度以次为0.631、2.653、5.780、0.983、10.545、4.586、10.680、15.320、14.460、14.840、54.250、106.958、104.360、69.590、64.858和137.608μg／ml。各组份蛋白浓度的差异很大，说明在蝮蛇粗毒中的含量不同。五、高效液相色谱分离的蛋白组份对人肝癌Hep3B细胞抗肿瘤活性的形态学影响以培养人肝癌Hep3B细胞为模型，对分离得到的16个蛋白组份进行了抗肿瘤活性的筛选与评价。在这16个蛋白组份中，组份3、4、5对培养人肝癌Hep3B细胞有明显的抗肿瘤活性，我们将这三个蛋白组份分别命名为AHP-3（蝮蛇英文Agkistrodon Halys Pallas第一个字母的缩写）、AHP-4、AHP-5。本文研究考查了AHP-5对人肝癌Hep3B细胞抗肿瘤活性的形态学影响。在无AHP-5处理的情况下，Hep3B细胞呈单层生长，细胞分布均匀，成梭形，生长良好。用140μg／ml的AHP-5处理Hep3B细胞，24h后，倒置显微镜下观察发现，细胞生长状态明显较对照组差，并且细胞的体积变小、变形，细胞出现皱缩、变圆、脱落等现象；透射电镜观察结果显示：细胞体积缩小，染色质浓缩，细胞核裂解为碎块。说明AHP-5对Hep3B细胞具有明显的抑制和凋亡作用，AHP-5对培养人肝癌Hep3B细胞有明显的抗肿瘤活性。六、电泳法确定AHP-5的肽链结构我们采用SDS还原电泳法鉴定AHP-5的肽链结构。结果表明，AHP-5在还原电泳条件下，呈出现一条区带，表明AHP-5为单一肽链组成的蛋白质。七、AHP-5 N-端部份氨基酸序列的测定采用Edman降解法对AHP-5 N-端第1至第15位的氨基酸进行了序列测定，结果表明，AHP-5 N-端15个氨基酸序列依次为HLLQFRKMIKKMTKK。经GenBank中protein-protein BLAST的检索，AHP-5的氨基酸序列与目前已知的蛋白质序列进行比较，未检索到与AHP-5 N-端第1位至第15位氨基酸一致的氨基酸序列，表明AHP-5是一种新的蛇毒多肽。同时AHP-5 N-端的15个氨基酸与已知的其它蛇毒磷脂酶A2（PLA2）具有较高的同源性，因此初步推测该组份为PLA2同源物。八、AHP-5对人肝癌Hep3B细胞抗肿瘤活性机理的初步研究由于我们从蛇毒中分离提纯出的PLA2同源物为一新发现的蛋白组份，其生理药理效应未知，因此我们应用SuperArray芯片，对其进行初步的机理探索。结果显示，用140μg／ml PLA2同源物作用于Hep3B细胞12h后，在所选择的112个基因中，有19个基因表达下调，20个基因表达上调。在下调基因中，下调倍数超过10倍的3个基因，ICAM-1，Integrinα1和LFA1b的主要功能都是介导细胞黏附。在上调基因中，上调倍数超过10倍的基因有Bcl-2和Fas，其主要功能是参与细胞调亡和衰老；Integrinαv，其主要功能是参与细胞黏附；Thrombospondin 2，其主要功能是参与血管生成；MTS1和PAI-2，其主要功能是参与肿瘤细胞入侵和转移。PLA2同源物具有极为广泛的作用靶点。九、AHP-5对人肝癌Hep3B细胞周期变化和Ca2+浓度的影响流式细胞仪检测细胞周期的变化，结果显示：Hep3B细胞经140μg／ml和208μg／ml的AHP-5处理后，G1期细胞数量逐渐减少，而S期细胞逐渐增多，G2期则没有明显的变化。结果说明：AHP-5可以抑制Hep3B细胞的生长，使细胞停滞于S期。此外，经过处理后的细胞，其二倍体峰前均发现有明显的亚G1峰（凋亡峰），提示有凋亡现象的发生。共聚焦显微镜观察发现，经过AHP-5处理后的细胞，其膜外表面有明显的磷脂酰丝氨酸表达，Hep3B细胞内钙离子的浓度明显升高，说明AHP-5诱导Hep3B细胞凋亡。根据上述实验结果，本论文的结论如下：一、建立了一种从蝮蛇蛇毒粗毒中快速分离蛋白组份的高效液相色谱方法。该方法采用大孔径反相硅胶C18制备层析柱，以乙腈／水（0.1％三氟乙酸）为流动相，在时间为0～120min进行梯度洗脱，能一次性从蝮蛇粗毒中分离出16个纯度达95％以上的蛇毒蛋白组份。二、在分离得到的16种蛇毒蛋白组份中，有三种组份在体外对人肝癌Hep3B细胞有抗肿瘤活性。形态学结果表明，140μg／ml的AHP-5处理Hep3B细胞24h后，倒置显微镜下观察细胞生长状态明显较对照组差，并且细胞的体积变小、变形，细胞出现皱缩、变圆、脱落等现象；透射电镜观察结果显示：细胞体积缩小，染色质浓缩，细胞核裂解为碎块。说明AHP-5对Hep3B细胞具有明显的抑制和促凋亡作用，抗肿瘤活性明显。三、凝胶电泳、分子量测定和氨基酸序列分析的结果表明，AHP-5的分子量为13900Da，是由一条多肽链组成的蛋白质，N-端第1位至第15位的氨基酸序列为HLLQFRKMIKKMTKK。经GenBank中的protein-protei BLAST检索及人工检索，在已知多肽的N-端第1位至第15位氨基酸序列中，未发现与AHP-5结构相同的多肽，但与磷脂酶A2（PLA2）具有较高的同源性，因此推测该组份为PLA2同源物。四、对AHP-5抗肿瘤作用机理的初步研究结果表明，AHP-5（PLA2同源物）作用于Hep3B细胞后，可影响细胞多种基因的表达，表达改变的基因主要参与肿瘤细胞的生长和转移。本研究为进一步深入研究AHP-5对肿瘤细胞的作用机制提供线索和依据。
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