灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）突变体库的构建及致病相关基因克隆和鉴定

论文摘要

灰葡萄孢菌（Botrytis cineea）既是一种重要的植物病原真菌,也是研究植物与微生物相互作用的重要模式生物之一,从全基因组水平分析研究该真菌关键基因的功能,可以加速对灰葡萄孢生物学及其致病分子机制的认识。本实验利用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的T-DNA插入技术对灰葡萄孢菌进行了遗传转化,转化效率达每106个分生孢子>80个转化子,得到了 465多个转化子,并对转化子进行了遗传选择标记潮霉素抗性稳定性检测以及单胞分离纯化和单核鉴定后,进行了番茄叶片侵染测定,筛选出了几个抗性稳定遗传且致病力降低的转化子,通过PCR扩增选择标记基因潮霉素基因对转化子进行了分子鉴定。利用热不对称交错PCR（TAIL-PCR）技术扩增了 11个转化子的T-DNA插入位点旁侧序列,共扩增出43个侧翼片段,经过载体克隆成功完成了 27个片段的序列测定,并对序列进行了分析,获得了 9个T-DNA插入到基因内部的突变体。对插入的T-DNA边界序列进行分析后发现,左边界（left border,LB）整合到真菌基因组的概率较高,碱基缺失较少,有的保持完整,缺失后的序列和完整的LB序列相比相似度在59-90%范围内。而右边界（right border,RB）及其近邻的T-DNA区域缺失碱基较多,大部分片段的RB序列全部丢失。RB的碱基切除位置则有一定的保守性,发生在5’-TTTG-和其后的碱基-A-3’之间。除了碱基丢失,还发现有额外的序列的插入,不同插入位置的T-DNA中额外插入的碱基序列和长度不同。选取其中致病性减弱的转化子进行Southern blot分析,发现3个为T-DNA单拷贝插入,这三个转化子分别是7、H-96和H-79。根据T-DNA旁侧序列分析,其中7号突变体中T-DNA插入基因编码功能未知蛋白。H-96中T-DNA插入位点的预测基因编码一种与含未知功能的结构域DUF221家族蛋白相似的蛋白。H-79中T-DNA插入的预测基因编码一种与真菌蛋白磷酸酶2A调控B亚基（protein phosphatase 2A regulatory B subunit）相似的蛋白,H-79 突变体表现为生长速率减缓、产孢能力减弱、菌丝稀疏、对番茄的致病能力减弱,该基因命名为BcPP2A。利用RT-PCR分析表明该基因表达丧失,从而基因表达水平上确认基因功能的插入失活。克隆了 BcPP2A的基因组序列（启动子-编码区-终止序列）,构建双元表达载体并转入农杆菌进行该基因遗传互补和功能验证。利用RACE技术对BcPP2A全长cDNA进行了初步克隆试验。另外,对7号突变体进行了遗传互补及表型鉴定。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 灰霉病的发生状况
• 1.2 灰葡萄孢菌的致病分子机制研究进展
• 1.2.1 酶类
• 1.2.2 毒素
• 1.2.3 G蛋白信号转导途径的调控因子
• 1.3 农杆菌介导的灰葡萄孢菌转化及T-DNA标签在基因克隆上的研究进展
• 第二章 灰葡萄孢菌突变体库的建立及筛选
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 载体
• 2.1.3 主要供试试剂及仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 农杆菌AGL-1感受态细胞制备
• 2.2.2 农杆菌介导的灰霉转化
• 2.2.3 转化子生物学性状分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 灰葡萄孢菌转化子获得以及抗性稳定性检测
• 2.3.2 突变体的生物性状
• 2.3.3 致病力测定
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 T-DNA插入的分子鉴定及突变体插入位点侧翼序列的克隆分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 供试试剂及仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 转化子基因组DNA提取
• 3.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.2.3 转化子的PCR分子验证
• 3.2.4 转化子中T-DNA插入位点侧翼序列的克隆和测序
• 3.2.5 T-DNA插入灰葡萄孢基因组交界区的PCR验证
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 转化子基因组DNA的提取
• 3.3.2 转化子潮霉素基因PCR检测
• 3.3.3 灰葡萄孢菌基因组T-DNA旁侧序列的克隆分析
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 T-DNA插入模式的Southern blotting分析、目标基因RT-PCR分析及全长cDNA克隆
• 4.1 材料
• 4.1.1 供试菌株
• 4.1.2 供试试剂及仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 Southen blot分析
• 4.2.2 RT-PCR检测T-DNA插入的基因是否表达
• 4.2.3 RACE技术克隆全长cDN A
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 Southern blotting
• 4.3.2 转化子RT-PCR分子鉴定
• 4.3.3 RACE技术克隆全长cDNA结果分析
• 4.4 小结与讨论
• 第五章 目标基因全长序列克隆、表达载体构建以及突变体遗传互补
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 试剂与仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 入门载体pENTR/D-TOPO-Bc79的构建
• 5.2.2 构建pCAMBIA-Bar-Bc 79载体
• 5.2.3 互补转化子的获得及表型分析
• 5.3 结果与分析
• 07803.1的克隆'>5.3.1 H-79转化子基因BC1G₀7803.1的克隆
• 5.3.2 构建pENTR/D-TOPO-Bc79质粒
• 5.3.3 构建pCAMBIA-Bar-Bc79及pCAMBIA-Bar-Bc7质粒
• 5.3.4 互补转化子的获得及表型分析
• 5.4 小结与讨论
• 第六章 结论与展望
• 参考文献:
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文