抗DNA-PKcs单链抗体的筛选鉴定及对HeLa细胞的放射增敏作用

论文摘要

恶性肿瘤严重威胁着人类健康。放射治疗是恶性肿瘤主要治疗手段之一。然而,放疗可导致肿瘤周围正常组织受损,从而导致严重的副作用,同时,部分肿瘤细胞具有耐放射的生物学特性,或在放疗过程中,使肿瘤细胞产生诱导耐受性,导致治疗效果降低。目前,如何降低放疗剂量、提高治疗效果、减少肿瘤细胞耐受,即增强肿瘤放疗的辐射敏感性已成为肿瘤研究领域的热点之一。放疗对肿瘤细胞的杀伤效应主要是通过诱发其DNA双链断裂（DNA double- strand breaks, DSBs）,从而导致肿瘤细胞程序性死亡或坏死。出现DSB后,细胞会对其修复,以保证基因组结构的完整性,这也是肿瘤细胞抵抗放疗的主要机制之一,DNA修复能力越强,对放射的抗性越突出。哺乳动物细胞对DSB损伤修复主要有非同源末端连接（nonhomologous end-jioning,NHEJ）和同源重组（homologous recombination,HR）两条途径。DNA依赖的蛋白激酶复合物（DNA-dependent protein kinase,DNA-PK）是NHEJ途径中重要的组成成分。该复合物由调节亚单位Ku70/Ku80异源二聚体和催化亚基DNA-PKcs（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit）组成。DNA-PKcs通过自磷酸化及磷酸化其他效应蛋白如XRCC-4、Artemis,在DSB修复中发挥重要作用。另外,DNA-PKcs还参与细胞周期G2期调控及细胞凋亡和自吞噬死亡,还可参与V（D）J重组过程、维护端粒长度。近年来,研究表明DNA-PKcs在多种类型癌组织细胞中普遍高表达,具有高转移特性和放化疗抗性的癌细胞中DNA-PKcs的表达活性显著增高;特异性抑制DNA-PKcs导致细胞对γ射线及紫外线的敏感性增加,DNA-PKcs表达沉默细胞的生长速度和接种裸鼠后形成肿瘤的生长速度减慢,显示DNA-PKcs具有作为放射增敏抗癌分子靶标的重要价值。目前已有多种方式用以抑制DNA-PKcs功能,如典型的PI3K抑制剂渥漫青霉素（Wortmannin）、LY294002,特异的DNA-PKcs抑制剂OK-1035、NU7026,反义寡核苷酸,单克隆抗体以及Ku片段等。然而这些抑制剂或特异性较差、或用于机体可导致肝毒性或引起免疫反应,限制其实际应用。近年来随着人源抗体制备技术尤其是通过噬菌体抗体库筛选单链抗体技术的发展,为恶性肿瘤治疗的生物制药提供了新的技术方法。目前通过抑制DNA-PKcs用以增强肿瘤放疗敏感性的实用药物尚未上市,而针对DNA-PKcs的单链抗体制备未见有报道。本研究通过噬菌体抗体库技术筛选DNA-PKcs单链抗体,用以增加肿瘤细胞辐射敏感性的研究。获得如下主要结果:1、应用生物信息学分析软件Biosun对DNA-PKcs蛋白进行了抗原性分析,通过BLAST比对确定了抗原性高、且与其他蛋白没有同源性的蛋白片段DPK1、DPK2、DPK3及DPK4;RT-PCR扩增相应的基因序列,构建原核表达载体,转化E.coli BL21（DE3）,经优化表达条件以包涵体形式成功表达出250个氨基酸的DPK3和257个氨基酸的DPK4蛋白片段,经过包涵体蛋白变性、复性得到纯化的DPK3、DPK4。2、采用海军总医院中心实验室建立的天然大容量噬菌体抗体库,筛选针对DPK3、DPK4的特异性单链人源抗体。将一定浓度的纯化可溶性蛋白DPK3、DPK4分别包被抗原管,经过四轮“吸附—洗脱—扩增”的淘筛过程筛选特异性抗体,获得26个结合DPK3及31个结合DPK4的克隆,抗体可变区基因指纹分析分别有5种和21种不同的可变区片段;将抗体基因转化E.coli HB2151成功制备了可溶性抗体,并应用ELISA方法做了抗原结合活性鉴定,最终得到抗DPK3的2个单链抗体和抗DPK4的5个单链抗体。抗体可变区基因测序后,经与轻链（κ链和λ链）及重链抗体数据库的比对,得出抗DPK3抗体基因（1、2）的重链可变区基因分属VH3、VH4亚群,轻链可变区同属于VL2亚群;抗DPK4抗体基因重链可变区基因（1、2、5、8、10）分属VH1、VH3亚群,轻链可变区分属于VL1、VL2亚群。3、应用Western Blotting检测anti-DPK3-scFv-2可溶性抗体的特异性,并与商品化抗DNA-PKcs兔多克隆抗体相比,结果显示所筛选获得的抗DPK3单链抗体特异的与DPK3片段结合而不与DPK4片段结合,并能结合细胞内DNA-PKcs蛋白,且其特异性较商品化抗体高。4、将anti-DPK3-scFv-2的基因序列插入真核表达载体pcDNATM3.1 /myc-His B,通过真核转染建立稳定表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞系。通过克隆形成实验确定HeLa-DPK3-scFv-2细胞系的辐射敏感性最强,以此细胞系进行了细胞内抗体功能实验。细胞增殖实验结果表明,表达anti-DPK3-scFv的肿瘤HeLa细胞的增殖能力受到了抑制。细胞克隆形成实验的结果表明表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞的辐射敏感性明显增加。说明细胞内抗DPK3抗体对辐射细胞的存活发挥了阻抑作用,增强了辐射敏感性。中性单细胞凝胶电泳以及γH2AX位点的检测都证明, anti-DPK3-scFv降低了辐射诱导的HeLa细胞的DNA双链断裂修复能力。细胞caspase-3活性检测结果显示,转染anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞照射后caspase-3活性与对照相比明显增高,表明辐射诱导HeLa-DPK3-scFv细胞凋亡增加,该细胞辐射敏感性增强。5、应用Western Blotting检测各细胞DNA-PKcs表达,结果表明anti-DPK3-scFv并不影响细胞内DNA-PKcs的表达。进一步检测细胞内DNA-PKcs的磷酸化底物Akt的磷酸化水平,结果显示HeLa-DPK3-scFv细胞经γ射线照射后Akt的磷酸化水平没有明显改变,表明HeLa-DPK3-scFv受照发生DNA损伤后,DNA-PKcs不能相应的激活下游的效应蛋白,不能完成对DNA损伤的修复,因而DSB修复受阻。综上所述,本课题获得了DNA-PKcs中抗原性高且与其他蛋白没有同源性的蛋白片段,经原核表达及蛋白纯化得到DPK3、DPK4蛋白片段;采用噬菌体抗体库等平台,分别筛选鉴定了DPK3、DPK4的特异性抗体,首次获得针对人DNA-PKcs的单链人源抗体;并在HeLa细胞表达所筛选的抗DPK3单链抗体,研究发现转染anti-DPK3-scFv的HeLa细胞增殖能力下降、辐射敏感性增强,DNA损伤修复能力受到抑制。这可能是由于细胞内表达的该单链抗体通过结合于DNA-PKcs表面某个蛋白相互作用位点,或是通过与DNA-PKcs的结合改变了DNA-PKcs的构象,从而阻碍了其参与DNA双链断裂的NHEJ修复过程,增强了细胞的辐射敏感性。本研究为进一步的肿瘤辐射增敏应用研究打下基础。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1. DNA-PKcs
• 2. DNA-PKcs 在 DSB 修复 NHEJ 中的作用
• 3. DNA-PKcs 在癌组织细胞中异常高表达并与增殖及抗辐射密切相关
• 4. 单链抗体技术
• 第一章 DNA 依赖蛋白激酶催化亚单位抗原性分析及相应蛋白片段的表达、纯化
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二章 从大容量噬菌体抗体库中筛选抗 DNA—PKcs 人源单链抗体
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三章 抗 DNA－PKcs 单链抗体对 HeLa 细胞放射增敏效应的实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 附录 单链抗体基因测序结果
• 文献综述
• 个人简历
• 致谢